王函,文辉,赖俊玉,蒋敏玲

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1],其发病机制与肾脏微炎症、细胞外基质扩张有关[2]。近年来,中国DN患病人数呈逐年增加趋势。钙通道阻滞剂治疗DN虽有一定疗效,但为了减轻这种共病的负担,迫切需要新的策略。中药常用于治疗DN等慢性疾病,其中黄芪常用于营养调节和免疫调节,既往研究将其作为DN的辅助治疗,具有一定的远期疗效及安全性。鬼箭羽富含生物活性成分,具有降糖作用,推测鬼箭羽可能会在DN治疗中发挥作用。黄芪—鬼箭羽方治疗DN的疗效能否进一步提高有待临床验证。黄芪—鬼箭羽方可用于治疗DN及其他需活血解毒的证候,通过正向调节脾、肾功能以增强体内正气,但其具体分子机制有待进一步研究。网络药理学在理论、方法和应用上均可用于药物发现,是一种确定药物靶点和分子机制的可行方法[3],利用网络药理学进行生物信息学分析可为中药配方在临床应用提供新的策略。本研究应用网络药理学结合体内实验揭示黄芪—鬼箭羽方治疗DN的相关核心靶点及分子机制,以期为DN的中医治疗提供新途径。

1 对象与方法

1.1 网络药理学分析方法

1.1.1 识别黄芪—鬼箭羽方的有效成分:利用PubMed、Google Scholar及中国知网数据库搜索和确定黄芪—鬼箭羽方的生物学和分子特征。基于摩尔灵感描述器分析,通过特定的算法和纳入标准[4],对从黄芪—鬼箭羽方中提取的大分子和小分子进行筛选和鉴定。

1.1.2 黄芪—鬼箭羽方和DN的选择目标:采用Swiss数据库中的“Homo sapiens”发现黄芪—鬼箭羽方的有效成分。利用“糖尿病肾病”“DN”等关键词预测人类基因,并通过GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)和Comparative Toxicogenomics Database(CTD)数据库获取简明的基因组信息,并采用维恩图在线平台将黄芪—鬼箭羽方有效成分的映射靶点与DN相关联[5]。

1.1.3 收集关键靶点,构建交互网络:将黄芪—鬼箭羽方中对治疗NE的有效成分的所有定位靶标输入String数据库,进行蛋白—蛋白相互作用(PPIs)的富集分析[5]。将黄芪—鬼箭羽方和DN中的相互靶标导入String数据库构建PPI网络,随物种调整参数为“Homo sapiens”,蛋白质相互作用的最小阈值为中等置信度>0.5,校正P<0.05。采用Cytoscape软件中的Network Analyzer工具识别关键靶点并描述其基本属性,采用度值算法筛选靶点,将得分最高的靶点确定为黄芪—鬼箭羽方对抗DN的关键靶点[6]。

1.1.4 注释和富集分析:使用Bioconductor软件包“GOplot”和“ClusterProfiler”对黄芪—鬼箭羽方治疗DN的总关键靶点的不同生物过程和分子途径进行富集和注释,该算法在导出数据前对P值(Cut-off为0.05)和Q值(Cut-off为0.05)进行标注和补充,以实现数据可视化[7]。

1.1.5 网络可视化分析:采用Cytoscape软件绘制表征和关联黄芪—鬼箭羽方治疗DN的有效成分中的关键靶点、生物过程和分子途径,运用全面的图表展示并可视化所有基于网络药理学的发现。

1.2 实验动物资料 选取雄性7周龄C57BL/6小鼠32只,由湖南STA实验动物有限公司(中国长沙)购买。实验程序得到桂林医学院动物中心伦理委员会批准(批准号:GLMC202006001)。

1.3 实验主要试剂 链脲佐菌素(上海源叶生物科技有限公司生产,批号S17049);黄芪—鬼箭羽方(广东一方制药有限公司生产);牛血清白蛋白溶液(武汉博士德生物工程有限公司生产,批号AR0004),一抗Caspase-3(GASP3)/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)(北京博奥森生物技术有限公司生产,批号33277M);二抗DyLight 488(碧云天生物技术有限公司生产,批号A0423);DAPI试剂(碧云天生物技术有限公司生产,批号C1002)。灵睿2型血糖仪和血糖试纸(杭州艾康生物技术有限公司生产,批号202102038)。尿蛋白定量测试盒(南京建成生物工程研究所生产,批号20210411)。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(苏州艾莱萨生物科技有限公司生产,批号分别为E20210201A、E20211201A)。

1.4 实验动物建模及治疗方法 将实验小鼠饲养1周,取8只正常小鼠设为空白对照组,每天仅采用水提取液(10 ml/kg、20 ml/kg)进行灌胃。取24只小鼠制作DN模型(血糖>11.5 mmol/L)[8],将其中8只纳入DN组,每天仅采用水提取液(10 ml/kg、20 ml/kg)进行灌胃;16只每天予黄芪—鬼箭羽方(黄芪∶鬼箭羽为2∶1)进行灌胃,其中8只给药剂量为10 ml/kg,为小剂量组,8只给药剂量为20 ml/kg,为大剂量组。各组均灌胃4周。

1.5 观察指标与方法 比较4组小鼠肾脏指数、血糖、体质量、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平及GASP3、RAC-α丝氨酸/AKT1阳性细胞。灌胃4周后,小鼠禁食,用血糖监测仪测定血糖水平;通过生化试剂盒收集小鼠尿液样本测定蛋白尿,并通过冷冻离心分离血液样品并制备血清,采用酶联免疫吸附试验测定血清TNF-α和IL-6水平。此外,将小鼠处死,分离小鼠肾脏样品并储存在-80 ℃下进行免疫荧光染色,测量肾脏重量,计算肾脏指数。

免疫荧光染色:用5～6 μm石蜡切片制备蜡包埋的肾组织,将这些切片在用5%新鲜制备的牛血清白蛋白溶液封闭前,先进行脱蜡和再水合。洗涤后,切片与一抗GASP3/AKT1(1∶200,细胞信号传导,美国;1∶100,波斯特,中国)在4 ℃下孵育过夜。洗涤后,切片再次与二抗DyLight 488孵育。细胞核用DAPI试剂染色。如前所述,在不同的显微镜视图下筛选并确定肾脏切片中的绿色荧光阳性细胞,进行细胞计数。在阳性细胞计数前,至少使用4个非重叠点进行成像以筛选阳性细胞。

2 结 果

2.1 候选靶标和蛋白互作网络 通过现有数据库发现2 962个DN敏感靶点,还确定了247个黄芪和172个鬼箭羽有疗效的靶点,进一步分析确定了黄芪—鬼箭羽方和DN的113个相互关联靶点,见图1。使用SPRING数据库收集了这113个相互关联靶点与功能相关的PPIs数据,构建黄芪—鬼箭羽方与DN相关的靶功能相互作用网络,见图2。

图1 黄芪—鬼箭羽方与DN的靶点及共同靶点维恩图

图2 黄芪—鬼箭羽方中所有共享靶点与DN相关性的网络图

2.2 拓扑参数和核心靶点的发现 对黄芪—鬼箭羽方与DN进行拓扑分析后,目标点的中位数自由度为36.839,最大自由度为88。随后,确定核心靶点的标准范围为74～88。结果发现黄芪—鬼箭羽方对抗DN的详细核心靶点包括AKT1、IL-6、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、转录因子AP-1(JUN)、CASP3,见图3。

图3 确定黄芪—鬼箭羽方对抗DN的所有核心靶点网络图

2.3 基因本体论(GO)相关过程和信号通路 对美沙拉嗪抗结肠炎的7个核心靶点进行了基于氧化石墨烯和京都基因和基因组百科全书(KEGG)的富集分析,GO分析的生物过程包括葡萄糖输入调节、葡萄糖输入、葡萄糖跨膜转运调节、葡萄糖跨膜转运、胰高血糖素分泌、白细胞激活参与炎性反应、神经炎性反应,积极调节神经炎性反应及急性炎性反应,调控IL-6水平,参与免疫反应细胞因子产生的调控、免疫系统过程的负调控、参与免疫反应的细胞因子的产生及淋巴细胞介导的免疫的正调控,见图4。

图4 基于GO的顶级计数筛选核心靶点

KEGG相关分子通路包含糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、细胞因子—细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、白介素-17(IL-17)信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Th17细胞分化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、c型凝集素受体信号通路、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、鞘脂信号通路、神经营养因子信号通路、PI3K-AKT信号通路、松弛素信号通路、Nod样受体信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、Fc蛋白RI信号通路,见图5。

图5 核心靶点中筛选KEGG的顶级计数

2.4 网络关系发现 整合了网络药理学的研究结果,以突出黄芪—鬼箭羽方抗DN的网络关系,这些网络关系与所有核心靶点、基于GO的生物过程和KEGG相关的分子途径有关,见图6。

图6 黄芪—鬼箭羽方抗DN的核心靶点、生物学过程和分子通路间网络图

2.5 4组小鼠临床治疗效果比较 与空白对照组相比,DN组、小剂量组、大剂量组肾脏指数、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平升高,体质量降低(P<001);与DN组相比,小剂量组、大剂量组肾脏指数、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,体质量增加(P<0.01);与小剂量组相比,大剂量组肾脏指数、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,体质量增加(P<0.01),见表1。

表1 4组小鼠临床治疗效果比较

2.6 4组小鼠GASP3和AKT1阳性细胞数比较 与空白对照组相比,DN组、小剂量组、大剂量组GASP3和AKT1阳性细胞数增多(P<0.01);与DN组相比,小剂量组、大剂量组GASP3和AKT1阳性细胞数减少(P<0.01);与小剂量组相比,大剂量组GASP3和AKT1阳性细胞数减少(P<0.01),见表2。

表2 4组小鼠GASP3和AKT1阳性细胞数比较个,n=8)

3 讨 论

DN是一种由高血糖引起的肾炎综合征,在糖尿病终末期可恶化,导致肾衰竭,因此,需采用药物治疗DN,现有部分中药被用于DN的预防和治疗,如黄芪、鬼箭羽。中草药可有效纠正代谢异常,减轻炎性反应和氧化应激反应,增强免疫功能,并调节肾微小RNA[9]。既往有研究概述了黄芪、鬼箭羽治疗DN的治疗效果[10],但黄芪和鬼箭羽治疗DN的药理机制尚不清楚。本研究通过计算和算术数据确定了黄芪—鬼箭羽方对抗DN的候选和核心靶点及信号通路,核心靶点包括AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3,这些关键基因在功能上可减轻炎性反应、增强机体免疫和改善肾组织微环境。中医学理论认为,采用黄芪—鬼箭羽方治疗DN具有“肾消”“水肿”和“关格”的抑制作用。本研究结果显示,与DN组相比,小剂量组、大剂量组肾脏指数、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,体质量增加;与小剂量组相比,大剂量组肾脏指数、血糖、尿蛋白及血清TNF-α、IL-6水平降低,体质量增加,表明黄芪—鬼箭羽方治疗DN小鼠可增加体质量,减小肾脏,降低血糖、尿蛋白和炎性细胞因子,尤其大剂量用药效果更佳。前一项体内研究结果表明,黄芪—鬼箭羽方通过药理活性可有效抑制DN。通过进一步的网络药理学数据验证,黄芪—鬼箭羽方处理的DN样本突出了GASP3、AKT1的肾内蛋白表达以剂量依赖的方式下调。GASP3在与程序性细胞凋亡或增殖相关的内在和外在途径中起着关键作用。据报道,激活GASP3表达会促进DN的发生发展。AKT1是一种原癌基因,在癌细胞中过度活跃,被认为是人类恶性肿瘤的脆弱基因。既往有报道称,AKT1与小鼠肾内缺血—再灌注损伤过程中的肾小管细胞凋亡和炎性反应有关[11]。根据目前的网络药理学分析,已确定的黄芪—鬼箭羽方的抗DN功能参与了炎性反应、免疫反应、细胞因子的产生和凋亡信号传导。因此,本研究结果提示,与DN组相比,小剂量组、大剂量组GASP3和AKT1阳性细胞数降低;与小剂量组相比,大剂量组GASP3和AKT1阳性细胞数降低,表明黄芪—鬼箭羽方的抗DN作用与GASP3/AKT1功能调节有关,尤其是大剂量用药效果更佳,后续还需进一步确定黄芪—鬼箭羽方中的抗DN靶点。

PharmMapper是一种表征黄芪—鬼箭羽方有效成分化学结构的有效工具。Swiss-Prot的其他数据库,如Uniprot,旨在识别目标序列。本文采用生物信息学和实验数据揭示了黄芪—鬼箭羽方对抗DN的药理机制和靶点。值得关注的是,一些核心靶点已经在黄芪—鬼箭羽方处理的DN小鼠中被验证,包括GASP3、AKT1。然而,在未来临床应用黄芪—鬼箭羽方治疗DN前,还需进行更多的临床前验证研究。

综上所述,通过网络药理学揭示了黄芪—鬼箭羽方抗DN的药理机制和靶点,临床前实验表明黄芪—鬼箭羽方可有效治疗DN,尤其是大剂量用药效果更佳。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。