袁汉文，李云耀*，梁 玲，吕梦颖，王 炜*

1.湖南中医药大学中医药民族医药国际联合实验室，湖南 长沙 410208；2.湖南交通工程学院，湖南 衡阳 421001

中药栀子（Gardeniae Fructus）为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的成熟果实，习称山栀子。栀子为清热泻火药，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效，常用于热病心烦、湿热黄疸等疾病[1]。研究表明，栀子中主要成分为环烯醚萜类，如京平尼苷（Geniposide）、山栀苷（Shanzhiside）、羟异栀子苷（Gardenoside）等[2]。 此外，栀子中还含有大量的二萜类化合物，如西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、西红花苷Ⅲ等[3]。 栀子具有保肝利胆、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗病原微生物等多种药理作用[4]。 栀子苷被认为是栀子的主要有效成分，在2020 版《中华人民共和国药典》 中，TLC 鉴别主要检测其是否存在栀子苷，HPLC 含量测定规定栀子中栀子苷的含量以干燥品计，不得低于1.8%[1]。 大花栀子（Gardenia jasminoides Eills var.grandiflora Nakai）为栀子的变种，其果实习称水栀子，外形较中药栀子略大，化学成分与中药栀子高度相似，但历来不作药用，是中药栀子最常见的混淆品[5]。

本研究利用HPLC 双波长法对栀子中的主要成分进行了分析，建立了栀子特征图谱，并通过与对照品溶液进行比较鉴定了11 个主要成分。 PCA 和PLS-DA 分析结果表明，山栀子和水栀子主要的化学成分没有明显差异。 此外，本研究还建立了6 个主要成分的含量测定方法，并利用LC-Orbitrap-MS技术从栀子中鉴定了31 个成分。

1 材料

1.1 试剂

HPLC 级甲醇（批号：WXBD9351V）和乙腈（批号：WXBF0117V）购自美国Sigama Aldrich 公司，其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。 所有水溶液均使用怡宝纯净水（华润怡宝饮料有限公司）制备。对照品西红花苷Ⅰ（批号：DST191027-142）、栀子苷（批号：DST200713-032）、羟异栀子苷（批号：DST210715-126）、栀子新苷（批号：DST200723-122）、西红花苷Ⅱ（批号：DST200527-012）、西红花苷Ⅲ（批号：DST210210-145）、鸡矢藤次苷甲酯（批号：DST211020-108）、京尼平苷酸（批号：DSTDJ004001）、山栀苷（批号：DST210718-142）购于成都乐美天制药科技有限公司，其他对照品，包括去乙酰车叶酸甲酯（批号：ST19440120），京尼平龙胆双糖苷（批号：ST56070120）购于上海诗丹德生物技术有限公司。 所有对照品经HPLC 测定，其纯度在98%以上。

1.2 药材

15 批山栀子和9 批水栀子课题组收集于湖南、江西、安徽等省份的不同城市，并由湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为栀子（Gardenia jasminoides Eills）或大花栀子（Gardenia jasminoides Eills var.grandiflora Nakai）的干燥成熟果实。

1.3 主要仪器

1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；AE100S 型电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ2200DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CTH1850 型台式高速离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；101 型电热鼓风干燥箱（北京市光明医疗仪器有限公司）；Vanquish Flex UHPLC 与Orbitrap Exploris 120 质谱仪联用系统（赛默飞世尔科技）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

HPLC 分析流动相由乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）组成，梯度洗脱程序为：0～30 min，5%～30%A；30～60 min，30%～50% A；60～65 min，50%～95%A；65～70 min，95% A。检测波长为240 nm 和440 nm（0～28.5 min 检测波长为240 nm；28.5～70 min 检测波长为440 nm），流速为1 mL/min，柱温维持在30 ℃，进样量为10 μL。 色谱柱为Agilent 5 TC-C18（5 μm,4.6 cm×250 cm)。

LC-Orbitrap-MS 分析流动相由乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）组成，梯度洗脱程序为：0～40 min，5%～50% A；40～45 min，50%～95% A；45～50 min，95% A。 流速为0.3 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为1 μL，色谱柱为Hypersil GOLDTM Aq-C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。 正负离子模式下喷雾电压分别为2 500 V 和3 500 V；鞘气10 Arb；离子传输管温度，325 ℃；碰撞能量30 eV；MS 扫描范围100～1 000 Da；MS2 扫描范围50～1000 Da。

2.2 对照品溶液制备

精确称取对照品适量，并将其单独溶解在甲醇中，以获得储备溶液。 此后，通过混合和稀释储备溶液获得一系列混合标准溶液，所有标准溶液于4 ℃避光保存。

2.3 样品溶液制备

山栀子与水栀子药材粉碎后过80 目筛，即得样品粉末。 取样品粉末1.000 0 g，置于50 mL 锥形瓶中，加25 mL 甲醇，超声提取30 min，10 000 r/min 离心10 min 后，取上清液，即得。

2.4 特征图谱建立

对柱温、进样量、流动相、提取溶剂等进行了考察，为保证各色谱峰的分离效率，最终确定的最佳色谱条件如2.1 项下所示，栀子的HPLC 色谱图如图1所示。取同一份样品，连续进样6 次，考察其精密度。取同一份样品，分别在0、4、8、12、24、48 h 进样分析以考察稳定性。 取同一样品，平行制备6 份，进样分析考察重复性。取同一份样品，使用3 种不同的色谱柱，在两台不同品牌的液相仪器上进行进样分析，考察方法的耐用性。记录色谱图，以及各共有色谱峰的保留时间（Rt）和峰面积（PA）。 并以栀子苷为参照物，计算各色谱峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）的相对标准偏差（RSD），结果见表1。 耐用性考察中1 号峰和3 号峰RRT 略大于5%，分别为5.95%和6.12%，其余各项考察各色谱峰RPA 和RRT 的RSD 值均小于5%，说明该方法稳定可靠。 将15 批山栀子与9 批水栀子按上述方法制备样品溶液并进样分析，记录色谱图并将其导入到中药色谱指纹图谱相似性评价系统（2004 A 版）软件中进行分析，建立其特征图谱（图2）。 大部分山栀子在图2—9 方框1 和方框2 标记处分别有3 个小峰，而在水栀子中这些位置均没有明显的峰，但山栀子中也有在这些位置没有峰的样品如S15 和S6，故仅利用这些特征也难以准确地鉴别山栀子和水栀子。

图1 栀子HPLC 色谱图

图2 山栀子（A）和水栀子（B）指纹图谱

表1 方法学考察各色谱峰相对保留时间RSD（%）

将11 个主要成分的峰面积数据导入Simca-p 14.1 软件中进行PCA 和PLS-DA 分析，其得分图如图3 所示，山栀子和水栀子样品在图中没有明显的分离趋势，说明山栀子和水栀子化学成分差异不明显。

图3 PCA（A）和PLS-DA（B）得分图

2.5 含量测定

对6 个最主要的成分，包括栀子苷、羟异栀子苷、京尼平双糖苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、西红花苷Ⅲ进行了含量测定。 各化合物校正曲线、线性范围、LOD 和LOQ 考察结果如表2 所示。 将已知量的各对照品加入准确称量的样品中，并通过所述方法制备6 份，用于HPLC 分析。 回收率计算如下：回收率（%）=（测得量-样品中的量）/加入量×100%。 其回收率分别为95.9%、98.5%、98.0%、95.3%、99.3%、95.3%。 综上，各成分线性良好，该方法稳定可靠，可用于栀子的含量测定。含量测定结果表明（图4），栀子中主要成分为栀子苷、羟异栀子苷和西红花苷Ⅰ，栀子苷的含量高达7.25 mg/g，栀子苷和羟异栀子苷在山栀子和水栀子中含量没有明显差异。

图4 各样品含量测定结果(mg·mL-1)

表2 主要成分的校正曲线、线性范围、LOD、LOQ 结果

2.6 LC-Orbitrap-MS 分析

栀子将LC-Orbitrap-MS 总离子图如图5 所示，数据导入Compound Discoverer 软件中，进行空白扣除、峰对齐、解卷积、峰提取、谱库搜索（mzCloud、mzVault）、化合物匹配。 筛选mzClound best match≥90 且mzClound best match confidence≥60 或者mzVualt best match≥90 的化合物，得到初步鉴定的成分。排除可信度相对较低的成分，如某些化合物难以裂解产生二级碎片，或二级质谱图相应低，则会造成主要依靠母离子进行匹配而导致匹配度较高的假阳性结果，故可限定子离子匹配的个数，提高鉴定的准确性；另外，栀子中主要为含C、H、O、N 的成分，可排除含其他元素的成分，最终从栀子中鉴定了31个成分（表3）。

图5 栀子正离子模式（A）和负离子模式（B）总离子流图

表3 LC-Orbitrap-MS 鉴定结果

3 讨论

本文以大宗果实类药材栀子为研究对象，利用HPLC 对其主要成分进行分析，建立了栀子特征图谱，通过与对照品溶液进行比较鉴定了11 个主要成分，包括栀子新苷、山栀苷、京尼平苷酸、去乙酰车叶酸甲酯、羟异栀子苷）、鸡矢藤次苷甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花Ⅰ、西红花苷Ⅱ、西红花苷Ⅲ，并建立了其中6 个最主要成分的含量测定方法。水栀子是山栀子的变种，研究结果也表明，二者主要化学成分高度相似，仅部分微量成分有细微差异，水栀子能否作药用并代替山栀子有待深入研究。此外，本研究利用LC-Orbitrap-MS 结合Compound Discoverer 分析平台和mzCloud 和mzVault 二级质谱数据库对栀子中的成分进行了分析，并鉴定了31 个成分。 本研究建立的方法稳定可靠，可为木瓜和栀子的质量标准的提升提供理论依据，并能助力其国际化与现代化。