苑 萌，董慧文，刘佳丽，冯学辉，韩宝华，韩树池*，张志斌，卢 晶

河北北方学院附属第一医院急诊科，河北 张家口 075000

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是在严重感染、休克、创伤等非心源性疾病过程中由肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，临床上以进行性低氧血症和呼吸窘迫为主要表现，具有病死率高、救治难度大的特点[1-2]。 相关的分子生物学研究显示，活性氧（reactive oxygen species, ROS）/硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）/Nod 样受体蛋白3（Nod like receptor protein 3, NLRP3）通路介导的炎症反应、氧化应激反应在多种ALI 模型中与肺损伤加重有关[3-4]。 麻黄是具有抗炎、清除自由基、免疫调节等活性的药物，相关的动物实验证实麻黄水提物对药物性肾损伤、药物性肝损伤具有保护作用，并且其脏器保护作用与抑制炎症反应及氧化应激有关[5-6]。 为深入认识麻黄水提物在ALI 中的治疗价值，本文以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导ALI 大鼠为对象，研究麻黄水提物通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路减轻ALI 的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 雄性大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为[SCXK(京)2016-0011]，8 周龄，体质量240～260 g，共72 只。 饲养条件：12 h 昼夜交替，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%。实验过程遵循3R 原则。动物实验在河北北方学院实验动物中心开展，使用许可：SYXK（冀）2019-004。 本研究经医院伦理委员会批准（审批号：HBNV202307012098）。

1.2 药品及试剂

LPS（批号：82857-67-8）购自美国Sigma 公司；麻黄水提物由医院药剂科制备；ROS/NLRP3 激动剂三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide, TMAO）（批号:1184-78-7）购自美国MCE 公司；白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的酶联免疫吸附检测试剂盒（批号：SP12250）购自武汉赛培生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde, MDA）、总抗氧化力（total antioxidant capacity, T-AOC）及ROS 检测试剂盒（批号分别为SP30131、SP15821、SP13358）购自武汉赛培生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylineosin, HE）染色试剂盒（批号：G1120）购自北京索莱宝科技有限公司；TXNIP、NLRP3 特异性一抗（批号：ab263899）及β-actin 特异性一抗（批号：ab8226）购自美国Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、给药及脂多糖诱导肺损伤 实验动物分为正常对照组、模型组、麻黄水提物组、TMAO 组、麻黄水提物+TMAO 组，每组8 只。每组均在造模前进行灌胃给药，方法如下：正常对照组、模型组给予1 mL/100 g 生理盐水灌胃，每日1 次，连续10 d；麻黄水提物组参照文献[5-6]，将400 mg/kg麻黄水提物溶于1 mL/100 g 生理盐水中灌胃，每日1 次，连续10 d；TMAO 组参照文献[4]，将100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理盐水中灌胃，每日1次，连续10 d；麻黄水提物+TMAO 组将400 mg/kg 麻黄水提物和100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理盐水中灌胃，每日1 次，连续10 d。 末次给药后24 h，除正常对照组外，其余各组均参照文献[7]进行LPS 诱导ALI 造模，方法如下：腹腔注射0.5 mL LPS 溶液、剂量5 mg/kg，复制LPS 诱导ALI 模型，正常对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

1.3.2 标本取材及保存 造模后6 h， 采用断头法处死大鼠，于断头处留取外周血8 mL，3 000×g 离心5 min，分离血清并在-80 ℃储存。 剪开大鼠胸部皮肤暴露胸腔，分离并结扎右侧支气管，从左侧主气管注入磷酸盐缓冲液，观察到肺部膨隆后抽回液体，重复操作3 次，合并3 次回抽的缓冲液，250×g 离心10 min，分离上清作为肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF），放入-80 ℃储存。 取右侧肺组织，生理盐水清洗后，一部分在4%多聚甲醛中固定、制作石蜡切片，另一部分在液氮中冷冻后放入-80 ℃储存。

1.3.3 肺组织病理改变的检测 取肺组织的石蜡切片，按照HE 染色试剂盒的说明书进行染色操作，封片后在显微镜下观察肺组织病理改变。

1.3.4 细胞因子含量的检测 取血清样本和BALF样本，按照酶联免疫吸附检测试剂盒进行操作，检测IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量。

1.3.5 氧化应激指标及ROS 活力的检测 取液氮冷冻的肺组织约30 mg，加入生理盐水200 μL，研磨后将组织研磨液在4 ℃以12 000×g 离心10 min，取上清并按照试剂盒的说明书进行操作，检测MDA、T-AOC 的含量及ROS 的活力。

1.3.6 蛋白表达的检测 取液氮冷冻的肺组织约30 mg，加入200 μL 裂解液，匀浆提取组织蛋白并检测浓度，将含有30 μg 蛋白的样本加入聚丙烯酰胺凝胶中进行Western blot 实验。 电泳分离不同分子量的蛋白后电转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂牛奶室温封闭硝酸纤维素膜1 h，用TXNIP 一抗（1∶600 稀释）、NLRP3 一抗（1∶400 稀释）、TXNIP 一抗（1∶250 稀释）、β-actin 一抗（1∶5 000 稀释）4 ℃孵育硝酸纤维素膜过夜。 次日，用辣根过氧化物酶二抗（1∶2 000 稀释）室温孵育硝酸纤维素膜1 h，最后在凝胶成像系统（上海天能公司）内显影得到蛋白条带，计算蛋白条带的灰度值，以β-actin 为内参，计算TXNIP、NLRP3 的蛋白表达水平。

1.3.7 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理，实验数据均为计量资料，以“±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麻黄水提物及TMAO 对LPS 诱导ALI 大鼠肺组织病理改变的影响

正常对照组大鼠肺组织形态正常、结构清晰，未见明显炎症细胞浸润；模型组和TMAO 组大鼠均出现肺组织内炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚的病理改变；麻黄水提物组大鼠肺组织内炎症细胞浸润减少、肺泡间隔增厚改善；麻黄水提物+TMAO 组大鼠肺组织内炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚的病理改变较麻黄水提物组加重。 详见图1。

图1 各组大鼠肺组织的HE 染色（×400）

2.2 麻黄水提物及TMAO 对LPS 诱导ALI 大鼠BALF 中炎症细胞分类的影响

模型组大鼠BALF 中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均高于正常对照组（P<0.05）；麻黄水提物组大鼠BALF 中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均低于模型组（P<0.05）；TMAO 组大鼠BALF中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均高于模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）；麻黄水提物+TMAO 组大鼠BALF 中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均高于麻黄水提物组、低于TMAO组（P<0.05）。 详见表1。

表1 各组大鼠BALF 中炎症细胞分类的比较（×106/L）

2.3 麻黄水提物及TMAO 对LPS 诱导ALI 大鼠血清及BALF 中炎症细胞因子的影响

模型组大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量比例均高于正常对照组（P<0.05）；麻黄水提物组大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量均低于模型组（P<0.05）；TMAO 组大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）；麻黄水提物+TMAO组大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于麻黄水提物组、低于TMAO 组（P<0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠血清及BALF 中炎症细胞因子含量的比较

2.4 麻黄水提物及TMAO 对LPS 诱导ALI 大鼠肺组织中氧化应激水平的影响

模型组大鼠肺组织中MDA 的含量高于对照组，T-AOC 的含量低于正常对照组（P<0.05）；麻黄水提物组大鼠肺组织中MDA 的含量均低于模型组、T-AOC 的含量高于模型组（P<0.05）；TMAO 组大鼠肺组织中MDA 的含量高于模型组、T-AOC 的含量低于模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）；麻黄水提物+TMAO 组大鼠肺组织中MDA 的含量高于麻黄水提物组、低于TMAO 组，T-AOC 的含量低于麻黄水提物组、高于TMAO 组（P<0.05）。 详见表3。

表3 各组大鼠肺组织中氧化应激水平的比较

2.5 麻黄水提物及TMAO 对LPS 诱导ALI 大鼠肺组织中ROS/TXNIP/NLRP3 通路的影响

模型组大鼠肺组织中ROS 活力及TXNIP、NLRP3 的表达水平均高于正常对照组（P<0.05）；麻黄水提物组大鼠肺组织中ROS 活力及TXNIP、NLRP3的表达水平均低于模型组（P<0.05）；TMAO 组大鼠肺组织中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表达水平高于模型组，但差异无统计学意义（P>0.05）；麻黄水提物+TMAO 组大鼠肺组织中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表达水平高于麻黄水提物组、低于TMAO 组（P<0.05）。 详见图2 和表4。

表4 各组大鼠肺组织中ROS 活力及TXNIP、NLRP3表达水平的比较

图2 各组大鼠肺组织中TXNIP、NLRP3 的蛋白表达

3 讨论

ALI 是临床常见的呼吸系统危重症，系有非心源性因素引起的急性呼吸窘迫，表现为顽固性低氧血症，严重者可发展为多器官功能障碍，甚至死亡。从分子生物学机制分析，该病是失控性炎症反应引起的急性肺组织病理损伤，其特征为炎症细胞在肺内大量浸润、炎症介质过度释放，同时伴有ROS 大量产生、氧化应激反应激活[8-9]。 因此，针对ALI 的炎症反应和氧化应激反应进行抗炎及抗氧化治疗，对减轻肺损伤、降低死亡率具有积极意义。

麻黄是麻黄属植物草麻黄、中麻黄、木贼麻黄的干燥草质茎，其水提物具有抑制炎症反应、清除氧自由基、调节免疫应答等作用[10-11]，用于药物性肝损伤及肾损伤动物模型的治疗，起到脏器保护作用，并减轻炎症反应和氧化应激反应[5-6]。 LPS 诱导ALI 是研究ALI 常用的动物模型[12-13]，本研究在LPS 诱导ALI 大鼠中观察麻黄水提物减轻ALI 的治疗效果。结果显示：腹腔注射LPS 后模型大鼠出现了肺组织内炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚的病理改变，符合ALI特征，表明造模成功；经麻黄水提物干预后，肺组织的病理改变明显减轻，提示麻黄水提物对LPS诱导ALI 具有一定保护作用。

麻黄水提物的肾脏保护作用和肝脏保护作用与抑制炎症反应和氧化应激反应有关。 ALI 发生及进展过程中炎症反应激活的特征是中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞在肺内浸润增多，多种炎症细胞因子如（IL-1β、IL-18、TNF-α）释放增加。 因此，检测炎症细胞数目及炎症细胞因子含量能够反映ALI 进程中炎症反应的程度[14-15]。 氧化应激反应激活的特征是ROS 生成增多，引起脂质损伤并生成产物MDA，同时消耗多种抗氧化物并引起T-AOC降低，检测ROA 及MDA、T-AOC 能够反映ALI 进程中氧化应激的程度[16-17]。 本研究中，LPS 诱导ALI 大鼠的BALF 中炎症细胞数量、血清及BALF中炎症细胞因子含量、肺组织中ROS 及MDA 含量均增加，而T-AOC 含量降低，符合炎症反应及氧化应激反应激活的ALI 特征。 经麻黄水提物干预后，炎症细胞数量、炎症细胞因子及ROS、MDA 含量降低，T-AOC 含量增加，提示麻黄水提物用于LPS 诱导ALI 的治疗对炎症反应和氧化应激反应具有抑制作用。

多项研究表明，ROS/TXNIP/NRLP3 在肺炎、ALI、脓毒症等模型中与炎症反应、氧化应激反应的调控密切相关[18-19]。 ROS 不仅具有氧化活性，能直接介导氧化应激，导致组织的氧化损伤，还可促进TXNIP的表达，TXNIP 能激活NLRP3 炎症小体并引起下游多种炎症因子的成熟和释放，进而介导炎症反应的级联放大激活。 本研究中，模型组大鼠肺组织中TXNIP、NLRP3 的表达均增加；经麻黄水提物干预后，肺组织中TXNIP、NLRP3 的表达均能降低。 TMAO是ROS 激活剂，本研究单独使用TMAO 干预后进行LPS 诱导ALI 造模，与模型组比较，TMAO 组各项指标差异不显著，提示模型组大鼠体内ROS/TXNIP/NLRP3 通路已处于充分激活状态，加用TMAO 并不会进一步激活该通路，这一结果与国内王亚静在重症肺炎大鼠中的研究结果接近[4]；而与仅接受麻黄水提物干预的大鼠比较，经麻黄水提物与TMAO 联合干预后大鼠的肺损伤明显加重，炎症反应及氧化应激反应也发生激活，提示麻黄水提物干预减轻LPS 诱导ALI 的作用与抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有关。

综上所述，麻黄水提物能减轻LPS 诱导ALI、抑制肺部炎症反应和氧化应激，其机制可能与抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有关。麻黄水提物的生物学作用多样且复杂，是否还通过其他分子通路发挥减轻ALI 的作用尚不清楚，故而后续进一步探索其他信号通路在麻黄水提物减轻ALI 中的作用，有助于更全面地认识该药物的治疗价值及机制。