张文霞 康亚男

基金项目：

作者简介：

张文霞（1984—），女，汉族，本科，主管中药师，研究方向为中药药效物质基础。E-mail：zmtg2018@yeah.net

通信作者：

康亚男（1989—），女，汉族，本科，主管中药师，研究方向为中药药效物质基础。E-mail：1962628419@qq.com

【摘  要】

目的：采用星点设计-响应面法优化盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺。方法：建立HPLC测定鞣花酸含量，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）；检测波长为254 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为 30 ℃；采用星点设计-响应面法对甲醇浓度、提取时间、液料比3个因素进行考察，优选盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺。结果：优选所得的盐覆盆子中鞣花酸提取工艺为甲醇浓度73%、提取时间63 min、液料比60∶1，此条件下鞣花酸含量为0.353%。结论：本试验优选所得的提取工艺高效稳定、操作简易、可用于盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取。

【关键词】

盐覆盆子；鞣花酸；响应面法；工艺优化

【中图分类号】R284.2    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）22-0038-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322010

Optimization of Extraction Process of Ellagic Acid from Salt Rubus chingii Hu by Response Surface Methodology

ZHANG Wenxia  KANG Yanan*

Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dezhou 253500，China

Abstract：

Objective To optimize the extraction process of ellagic acid from Raspberry salina by central composite design response surface methodology. Methods HPLC was established to determine the content of ellagic acid. The mobile phase was acetonitrile -0.2% phosphoric acid solution （15∶85）; The detection wavelength is 254 nm， the flow rate is 1.0 mL·min-1， and the column temperature is 30 ℃; Three factors， methanol concentration， extraction time and liquid to material ratio， were investigated by central composite design response surface methodology to optimize the extraction process of ellagic acid， an effective component of salt raspberry. Results The optimum extraction process of ellagic acid from salt raspberry is that the concentration of methanol is 73%， the extraction time is 63 min， and the ratio of liquid to material is 60∶1. Under this condition， the content of ellagic acid is 0.353%. Conclusion The optimized extraction process is efficient， stable and easy to operate. It can be used for the extraction of ellagic acid， an effective component of raspberry salt.

Keywords：

Salt Rubus chingii Hu; Ellagic Acid; Response Surface Method; Process Optimization

覆盆子又名樹倭泡、树莓、掌叶覆盆子，为蔷薇科植物华东覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果实［1］，一般在夏初果实由绿变绿黄时采收。覆盆子收载于2020版《中国药典》，味甘、酸，性温，具有益肾固精缩尿、养肝明目功效，主要防治阳痿早泄、遗尿尿频、遗精滑精、目暗昏花［2］。覆盆子含有黄酮、酚酸、萜类等成分［3-4］，具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫力等作用［5-7］，其药用既有生品，也有盐制品。据报道［8-9］，鞣花酸具有改善肾小管损伤及肾纤维化活性作用，覆盆子盐炙后补肾固涩作用显著增强，可能与盐炙后鞣花酸含量显著升高有关。目前，对盐炙品中鞣花酸的提取工艺研究还未见报道，本实验以鞣花酸的含量为评价指标，采用星点设计-响应面法优化盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺，以期为盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取提供依据。

1  仪器与材料

1.1  仪器  LC-2030C3D Plus高效液相色谱仪（岛津公司）；Agilent Extend C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）（安捷伦科技有限公司）；DF110电子天平（佑科仪器仪表公司）。

1.2  材料  鞣花酸（批号：111959-201708）购自中国药品生物制品检定所；覆盆子购于江西（批号20200426），经本院药剂科康亚男主管药师鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实。

2  方法与结果

2.1  盐覆盆子中鞣花酸的含量测定

2.1.1  对照品溶液制备  精密称取鞣花酸对照品10.50 mg，置50 mL容量瓶中，加73%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.21 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2  供试品溶液制备  精密称定盐覆盆子粉末（过四号筛）1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入73%甲醇60 mL，称定重量，回流提取63 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3  色谱条件  采用Agilent Extend C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）色谱柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长：254 nm；进样量10 μL。色谱图如图1。

2.2  方法学考察

2.2.1  线性关系  精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL的容量瓶中，加入73%甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定分析，以峰面积Y对进样浓度X计算回归方程，得回归方程Y=2.436X+0.023（r=0.9996），表明在质量浓度0.0021～0.21 mg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

2.2.2  精密度试验  取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分析，连续进样测定6次。结果鞣花酸峰面积RSD为1.41%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3  稳定性试验  取盐覆盆子供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h内进样分析，结果鞣花酸峰面积RSD为1.83%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.2.4  重复性试验  取盐覆盆子，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。结果鞣花酸平均含量为0.349%，RSD为0.69%，表明所建立的方法重复性好。

2.2.5  加样回收率试验  取盐覆盆子0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入鞣花酸对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析并计算回收率。结果鞣花酸平均加样回收率为101.24%，RSD为1.68%。

2.3  响应面法优化鞣花酸提取工艺

2.3.1  单因素考察  以鞣花酸含量为评价指标，分别对甲醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%）、提取时间（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min）、液料比（10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1）进行考察。結果见图2，由图2可知，以70%的甲醇、回流提取60 min，50∶1液料比提取效果最佳。

2.3.2  响应面设计  在单因素试验的基础上，选择甲醇浓度、提取时间、液料比为考察因素，利用Box-Behnken软件设计鞣花酸的提取条件，实验设计方案和结果见表1和表2。

2.3.3  方差分析  方程回归分析及方差分析结果见表3。鞣花酸含量对甲醇浓度、提取时间、液料比的回归方程为：Y=0.35+0.008A+0.009B+0.031C+0.004AB+0.016AC-0.014BC-0.028A2-0.008B2-0.023C2。结果显示，在设定的区域内，所建立的模型达到极显著水平（P<0.0001），其中二次项中A2和C2的P值均达到了极显著水平（P<0.01），表明方程拟合较好。

2.3.4  响应面分析  应用 Design-Expert 9.0.4 软件绘制出所考察指标与影响较显著的3个自变量的等高线图，具体如图3所示。结果最佳提取工艺为：甲醇浓度73.32%、提取时间62.87 min、液料比58.76∶1，预测鞣花酸含量为0.355%。

2.2.5  试验验证  考虑到实际操作的方便可行性，将条件修正为：甲醇浓度73%、提取时间63 min、液料比60∶1，此条件下鞣花酸含量为0.353%，与预测值无显著差异，表明方程与实际情况拟合良好。

3  讨论

3.1  目标成分的选择  研究显示，鞣花酸药理作用广泛，既有抗炎、抗氧化、抑制细菌生长等活性，还具有改善肾小管损伤及肾纤维化作用，是覆盆子盐炙后补肾固涩作用增强的主要相关活性成分［8-9］。因此，本试验选择鞣花酸为目标成分进行工艺优化。

3.2  优化方法的选择  响应面法是一种通过回归方程来拟合各因素水平与响应值之间的函数关系，可精准预测任一条件组合下的响应值并直观地看出函数关系的优点，被广泛用于中药有效成分的提取工艺优化［10］。因此，本试验选择响应面法优选盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺。

3.3  流动相的选择  本试验考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸水、甲醇-酸水等不同液相条件，结果显示，以乙腈-0.2%磷酸水为流动相时，鞣花酸的峰形及分离度最好，这可能和鞣花酸是多酚二内酯结构有关，加入酸水可抑制其水解，从而改善峰形、增加分离度。

综上，鞣花酸是覆盆子盐制后补肾固涩作用增强的主要活性化合物。本实验优化所得的盐覆盆子中鞣花酸最佳提取工艺为：甲醇浓度73%、提取时间63 min、液料比60∶1，此条件下鞣花酸含量为0.353%，所建立的方法可为盐覆盆子有效成分的提取工艺研究和质量标准完善提供依据。

参考文献

［1］

国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［S］. 北京： 中国医药科技出版社， 2020：382.

［2］李熠雯， 周燕霞. 覆盆子及其制剂的质量控制研究进展［J］. 广州化工， 2020， 48（19）：36-37.

［3］孙乙铭， 许寿增， 俞春英， 等. 覆盆子成熟过程颜色表征及其与品质指标消长的相关性研究［J］. 中国中药杂志， 2021，46（6）：1379-1385.

［4］邓俊杰. HPLC-Q-TOF-MS技术在覆盆子指纹图谱建立和化学成分归属中的应用［J］. 海峡药学， 2020， 32（5）：23-26.

［5］陈青青， 李柯， 唐晓清， 等. 华东覆盆子果、茎与叶的酚类成分及抗氧化活性分析［J］. 食品科学， 2020， 41（24）：209-215.

［6］师聪， 解春芝， 张建萍， 等. 覆盆子不同极性溶剂提取物的抗氧化活性比較［J］. 食品科技， 2021， 46（1）：220-224.

［7］谢欣梅， 庞晓斌， 李晓婷. 覆盆子酮对糖尿病模型小鼠的降血糖作用及其机制研究［J］. 中国药学杂志， 2012， 47（23）：1899-1904.

［8］张希， 廖宇娇， 杨卓， 等. 覆盆子盐制前后化学成分及药效学变化研究［J］. 时珍国医国药，2020， 31（1）：140-142.

［9］王佳鸾， 赵俸艺， 张春红， 等. 鞣花酸提取、纯化及其生物活性研究进展［J］. 食品工业科技， 2022， 43（13）：416-424.

［10］陈丹丹， 班晓敏， 林夏， 等. Box-Behnken响应面法优化壮药黄杞中总黄酮的回流提取工艺［J］. 中国民族民间医药， 2022， 31（5）：46-51.

（收稿日期：2023-02-22  编辑：刘  斌）