汤泮泮 叶兴蓉 陆雪萍 李龙 谢佳颖 冯莉萍 陈旭 任萍 陆礼和

基金项目：

作者简介：

汤泮泮（1988—），男，汉族，硕士，主管药师，研究方向为中药及天然产物研究与开发。E-mail：690055283@qq.com

通信作者：

陆礼和（1987—），男，汉族，硕士，高级工程师，研究方向为天然产物及中药开发研究。E-mail： 657484647@qq.com

【摘  要】

目的：多指标综合评分法优化直缘乌头中草乌甲素渗漉提取工艺。 方法：在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、浸泡时间、乙醇用量、渗漉流速为影响因素，草乌甲素转移率和干膏率为综合评价指标，正交试验优化提取工艺。采用HPLC测定草乌甲素含量，检测波长260nm，流动相为0.2%三乙胺水溶液［用磷酸调节pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）。结果：最佳条件为药材粉碎过10目筛，加3倍药材量70%乙醇浸泡时间16 h，7倍药材量70%乙醇，渗漉流速2 mL/min，草乌甲素转移率＞95%。结论：该方法简便稳定、重复性好，为草乌甲素的进一步分离纯化与利用提供实验依据。

【关键词】

草乌甲素；综合评分；渗漉提取；正交试验

【中图分类号】R284.2    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）22-0025-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322007

Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction

Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm

TANG Panpan  YE Xingrong  LU Xueping  LI Long  XIE Jiayin  FENG Liping  CHEN Xu  REN Ping  LU Lihe*

Yunnan Institute of Materia Medica，Yunnan Provincial Key Laboratory for TCM and

Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming 651000，China

Abstract：

Objective Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm. Methods Based on the analysis of the single factor experiment results， orthogonal test were used to determine the effects of ethanol dosage，ethanol concentration，soaking time and percolation speed on the extraction process of Aconitum bulleyanumm.by taking the dry extract yield and transfer rate of Bulleyacinitine A are taken as theindices for the comprehensive evaluation.HPLC was employed to determine contents of Bulleyacinitine A with detection wavelengths of 260 nm and mobile phases of was 0.2% triethylamine aqueous solution ［pH（3.1±0.1） adjusted with phosphoric acid］ -acetonitrile （60∶40）. Results The optimum percolation process was to add 10 times amount of Aconitum bulleyanumm （sieve No.1） and the 70% of ethanol，and soak for 16 hours.The percolation speed was 2 mL/min per minute. Transferring rate of Bulleyacinitine A was more than 95%. Conclusion This optimized percolation process is simple and stable with good repeatability，it can provide a theoretical basis for Separation and purification of Bulleyacinitine A．

Keywords：

Bulleyacinitine A;Composite Score; Percolation Process; Orthogonal Test

草烏甲素是从天然植物中提取分离纯化得到的生物碱，具有较好的抗炎、镇痛及免疫调节作用，临床用于治疗风湿及类风湿性关节炎、肩周炎等［1］，与非甾体消炎镇痛药和阿片类镇痛药相比，草乌甲素的安全性较好［2-3］。从2005版、2010版、2015版、2020版《中国药典》二部均收载了草乌甲素原料及其制剂 ［4-7］，随着草乌甲素制剂在临床上的广泛应用，草乌甲素市场需求较旺盛，作为草乌甲素提取用原料药材需求量也不断增加。

目前草乌甲素只能从乌头属植物中分离得到，如滇西乌头（Aconitum bulleyanumm Diels）、粗茎乌头（Aconitum crassicaule W.T.Wang）［8］、长缘乌头（Aconitumm georgei Comber）［9］和直缘乌头（Aconitum transsectum Diels）［10］等，其中直缘乌头主要为工业生产草乌甲素的原料［11］。沈勇等［12-14］采用甲醇渗漉，张红彬［15］采用碱浸泡和石油醚回流提取，付彬彬［16］采用闪式提取草乌甲素，提取过程中碱性溶剂、有毒有害试剂回收利用较难把控，限制了工业化生产。本研究采用HPLC法建立了乙醇渗漉液中草乌甲素含量测定方法［17-18］，以草乌甲素转移率和干膏率作为指标进行综合评分，在单因素试验基础上通过正交试验［19］优化直缘乌头中草乌甲素渗漉提取工艺，为后续草乌甲素纯化研究提供技术支撑。

1  仪器与材料

1.1  仪器  DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；DHG-9145A电热鼓风干燥箱（上海一恒有限公司）；ME204/02型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；SK-8200HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2  材料  草乌甲素对照品（批号：100530-202103，含量以99.2%计）购于中国食品药品检定研究院；乙醇为食品级，三乙胺、磷酸、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，纯净水由Milli-Q纯水系统制备，其余试剂为分析纯。

直缘乌头药材（购于云南玉龙县），经云南省药物研究所正高级工程师苏钛鉴定为毛茛科直缘乌头Aconitum transsectum Diels的干燥根，草乌甲素含量为0.18%（根据文献［11］自测），批号：2020414。

2  方法与结果

2.1  溶液的制备

2.1.1  供试品溶液制备  取试验工艺中的渗漉液1mL，加相应70%乙醇，并定容至10mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2  对照品溶液制备  精密称取草乌甲素对照品10mg，置于50mL量瓶中，80%乙醇溶解定容至刻度，摇匀，分别精密吸取4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL于10mL量瓶中，80%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得（每1mL分别含0.08mg、0.10mg、0.12mg、0.14mg、0.16mg草乌甲素）。

2.2  指标成分的测定

2.2.1  色谱条件  Ecosil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；0.2%三乙胺水溶液［用磷酸调节pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）为流动相，检测波长260nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；进样量10μL。

2.2.2  线性关系考察  吸取“2.1.2”项下对照品溶液，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y=13751X+19.1（R2=0.9995），在0.08～0.16mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3  精密度考察  精密吸取“2.1.2”项下草乌甲素对照品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算其峰面积的RSD值为2.1%，表明该仪器精密度良好。

2.2.4  稳定性考察  取“2.1.1”项下供试品溶液分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算其峰面积RSD值为2.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5  重复性考察  精密量取“2.1.1”項下供试品溶液6份，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算其含量RSD值为2.2%，表明该方法重复性良好。

2.2.6  加样回收率试验  精密量取已知含量同一批渗漉液，平行取样6次，每份1mL，精密加入等量草乌甲素对照品溶液，按照“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算草乌甲素的平均加样回收率为99.45%，RSD为2.7%。

2.3  干膏的测定  精密量取25mL渗漉液至干燥恒重的蒸发皿，80℃水浴蒸干。常压105℃干燥至恒重，置干燥器冷却30 min，迅速称定重量，计算干膏重量。

2.4  评价指标  草乌甲素转移率越高，提取效果越好，可作为考察提取效果的主要指标，权重系数为 0.6，同时，干膏得率越小，说明杂质少，干膏得率可作为次要指标，权重系数为 0.4，因此以干膏得率和草乌甲素转移率为评价指标，对渗漉工艺进行综合评分［11-12］。

干膏得率＝渗漉液总体积×干膏重量/（取样体积×原药材重量）

草乌甲素转移率＝干膏草乌甲素含量×干膏重量/（原药材草乌甲素含量×原药材重量）

渗漉综合评分＝干膏得率/最大干膏得率×40＋草乌甲素转移率/最大草乌甲素转移率×60

2.5  单因素试验

2.5.1  粉碎度考察  取药材适量，粉碎，分别过4mm、10mm、24mm、50mm目筛各20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，装柱，加入5倍量80%乙醇，渗漉流速1mL/min，浸泡时间16 h，摇匀，直接取渗漉液0.45μm微孔滤膜过滤，结果发现，粉碎度10目筛时草乌甲素含有量最高及耗时较短，故选择其进行后续试验。

2.5.2  乙醇体积分数  取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量一定乙醇浓度湿润浸泡，浸泡时间16 h，装柱，加入5倍量相应乙醇浓度进行渗漉，渗漉流速1mL/min，考察50%、65%、80%、95%乙醇浓度对提取效果的影响。结果见表1，乙醇体积分数对综合评分影响较大，随着乙醇体积分数的增加，综合评分先升高再降低， 80%乙醇时综合评分最高。结合经济成本，选乙醇体积分数为70%、80%、90%乙醇作为正交试验的3个水平。

2.5.3  浸泡时间  取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，装柱，加入5倍量相应乙醇浓度进行渗漉，渗漉流速1mL/min，考察浸泡时间4 h、8 h、16 h、24 h对提取效果的影响。结果见表2，浸泡时间对综合评分影响较大，随着浸泡时间的增加，综合评分趋势放缓，浸泡时间16 h时综合评分最高。结合经济成本，故固定浸泡时间为8 h、16 h、24 h作为正交试验的3个水平。

2.5.4  乙醇用量  取药材粉碎过10目筛20 g， 3倍量80%乙醇湿润浸泡，浸泡时间16 h，装柱，渗漉流速1mL/min，考察乙醇用量5倍、7倍、9倍、12倍、17倍对提取效果的影响。结果见表3，乙醇用量对综合评分影响较大，随着乙醇用量的增加，综合评分趋势放缓，乙醇用量15倍时综合评分最高。结合经济成本，故固定乙醇用量为10倍、15倍、20倍作为正交试验的3个水平。

2.5.5  渗漉流速  取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，浸泡时间16 h，加入12倍80%乙醇进行渗漉，考察渗漉流速0.5mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min对提取效果的影响。结果见表3，渗漉流速对综合评分影响较大，随着渗漉流速的增加，综合评分趋势放缓，渗漉流速1mL/min时综合评分最高。结合经济成本，故渗漉流速为1mL/min、2mL/min、3mL/min作为正交试验的3个水平。

2.6  正交试验  在单因素试验基础上，取药材粉碎过10目筛20 g，以乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、渗漉流速 （C）、浸泡时间 （D） 为影响因素， 进行4因素3水平L9（34） 正交试验。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表5。

即各因素最优水平分别为A1、B2、C2、D2。方差分析（表7）结果显示，因素A的F值为26.168，大于F0.05（2，2）＝19.00，说明A（乙醇体积分数）对试验指标有显著性影响（P＜0.05），结合直观分析显示的A1水平较好，因此A因素选取A1水平，即渗漉提取的乙醇体积分数为70%。而B（乙醇用量）的F值为0.510、C（渗漉流速）F值为0.353均小于F0.05（2，2）＝19.00，表明B和C因素对试验指标无显著性影响（P＞0.05）。正交试验结果中综合评分显示，渗漉工艺为A1B2C2D2的评分最高，A因素为A1水平，与方差分析结果一致；B、C、D因素为 B2、C2、D2均取各水平的中间值，从渗漉效率和节约溶剂角度考虑也较为合理。综上，通过正交试验初步选择渗漉工艺条件为A1B1C2D2，即70%乙醇（3倍药材量）浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉（7倍药材量），渗漉流速2mL/min。

2.7  渗漉工艺验证试验  取药材粉碎过10目筛20 g，平行3份，加入70%乙醇（3倍药材量）浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉（7倍药材量），渗漉流速2mL/min，计算草乌甲素转移率和干膏得率，结果见表8。结果显示，草乌甲素平均转移率为97.94%，RSD为0.66%；干膏平均得率为45.73%，RSD为 0.72%；平均综合评分值为97.94%；结果表明，3次试验结果和正交试验综合评分96%～97%之间，RSD值为0.66%，表明该提取工艺参数 A1B1C2D2稳定、科学、可行。

3  讨论

草烏甲素在临床上广泛应用，市场需求较旺盛，提升草乌甲素的提取效率，是一项重要的研究工作。预实验曾对渗漉法和回流法提取进行比较，结果发现渗漉法的草乌甲素转移率高，故选择渗漉法。本文先对渗漉提取中粉碎度、浸泡时间、乙醇体积分数、乙醇用量、流速进行单因素试验，再对乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉流速、浸泡时间进行正交试验。在粉碎粒度考察时，发现过细时，未能达到渗漉提取效果，耗时较长，转移率较低，故直缘乌头在渗漉提取过程中不宜粉碎过细，避免渗漉过程中发生堵塞柱筒现象，影响渗漉效果。最终，采用最佳渗漉工艺为最粗粉加70%乙醇（3倍药材量）浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉（7倍药材量），渗漉流速2mL/min进行提取，耗时短，综合评分较高。该方法简便稳定、重复性好，为草乌甲素的进一步分离纯化与利用提供实验依据。

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（收稿日期：2023-03-01  编辑：陶希睿）