黄 煌,吕国荣,林迳苍,许相洋,曾世涌,程 晶

(泉州医学高等专科学校基础医学部,福建泉州 362011)

流行病学调查和相关研究显示,慢性宫内缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH) 和多种成年期慢性疾病易感性密切相关,比如代谢性疾病、心血管疾病、早产儿死亡等[1-2]。近年来课题组一系列研究成果表明,CIH和仔鼠胰岛素抵抗发生具有相关性[3-6]。2型糖尿病(T2DM)是因环境因素和遗传因素相作用而发生的多基因遗传疾病,胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是导致T2DM的2个环节。近年来细胞线粒体的功能缺陷或形态改变在T2DM发病过程中的作用被逐渐重视[7-9]。线粒体功能缺陷与胰岛素信号转导障碍可能有关,线粒体的基因缺陷可以导致脂质在骨骼肌积聚,影响骨骼肌的糖代谢;有报道称NDUFB6基因在线粒体呼吸链电子传递过程中起作用,NDUFB6基因多态性可以通过运动改善胰岛素的敏感性及其与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成酶的关系[10]。对此,本实验旨在探究在CHI条件下,仔鼠胰腺NDUFB6基因的改变及其与胰岛素抵抗的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

孕龄7 d SD大鼠24只[上海斯莱克公司SCXK(沪)2017-0005],体质量165～185 g;免疫组织化学试剂、蛋白免疫印迹(Western blot)实验试剂盒、亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)实验试剂盒、实时荧光定量PCR(qPCR)试剂等购自福州鼎鑫泰斯特科技有限公司;NDUFB6一抗、荧光标记二抗IgG购自美国Abcam公司;戊巴比妥钠由泉州医药高等专科学校附属人民医院制剂室保存备用;空腹血胰岛素(FINS)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海瑞番生物科技有限公司;血糖仪购自美国Johnson公司。DNA提取试剂盒、PGH载体购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 CIH模型制备及分组

孕龄7 d SD大鼠分成健康组和缺氧组,每组12只,参照前期研究方法[3-6,11-14]建立CIH模型。在泉州医学高等专科学校SPF动物实验室完成动物实验[SYXK(闽)2023-0012],缺氧组孕鼠放置在自制的缺氧箱内,每天8 h,氧浓度为 (10.0±0.5)%,以上过程重复至分娩前1 d,停止缺氧后孕鼠分笼喂养。首次缺氧1 h后孕鼠行动脉血气分析,判断妊娠期CIH模型造模是否成功。成功分娩后的第2周,2组仔鼠鼠尾采血,分别检测空腹血糖(FBG)、FINS;麻醉处死仔鼠,取胰腺组织,分别做免疫组织化学检查、Western blot、qPCR、BSP等实验。所有操作均符合泉州医学高等专科学校动物实验伦理学要求(审批号QZMCAE 20220701)。

1.3 仔鼠FBG、FINS检测

采用ELISA法测定FINS,血糖仪检测FBG;稳态模式评估胰岛素抵抗能力:胰岛素抵抗(HOMA-IR) = (FBG×FINS)/22.5。

1.4 免疫组织化学(二抗标记单荧光)检测NDUFB6蛋白的表达

仔鼠胰腺组织块固定和包埋、切片(厚度5 μm)、脱蜡入水;3%甲醇-过氧化氢室温孵育20 min,自来水清洗,微波加热修复抗原,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,划蜡;滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育20 min,滴加NDUFB6一抗,4 ℃孵育过夜,次日PBS清洗;滴加荧光标记二抗IgG,37 ℃避光孵育20 min,PBS清洗,晾干,中性树脂封片; 400×的荧光显微镜照相,分析图像。

1.5 Western blot检测NDUFB6蛋白的表达

试剂配制、提取总蛋白(将标本组织块剪碎,加入裂解液,玻璃匀浆器匀浆,充分裂解,离心后取上清液)、BCA测定蛋白浓度、制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶、蛋白样品变性、电泳,转膜,封闭,加入NDUFB6一抗,4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液-吐温(PBST)漂洗,5 min×3次。加入二抗溶液,室温条件下孵育1 h。再次PBST 漂洗,5 min×3次。用 Odyssey凝胶成像仪检测蛋白显色,蛋白条带定量。

1.6 qPCR检测NDUFB6 mRNA的表达

TRIzol法提取2组仔鼠胰组织总RNA,用TIANScript RT试剂盒逆转录为cDNA,反应体系混匀,反应条件25 ℃温浴10 min,42 ℃温浴50 min,95 ℃加热5 min。用RNase-free ddH2O将反应体系稀释至50 μL,-20 ℃保存。依据Genebank 数据库(Primer 5.0)设计以下引物序列:NDUFB6基因正、反向引物序列分别为5′-CTA GAC TGG CAA GAG GCC GA-3′和5′-CAA TCC TTG ACA CAT CCT GG-3′;内参GAPDH正、反向引物序列分别为5′-CAG GGC TGC CTT CTC TTG TG-3′和5′-TCT CGC TCC TGG AAG ATG GT-3′。qPCR的反应依据说明书操作,反应程序:95 ℃,15 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环40次。采用2-ΔΔCT计算NDUFB6 mRNA的表达水平。

1.7 CpG岛甲基化分析

1.7.1CpG岛预测

依据美国国家生物信息技术中心(NCBI)记录NC_005104.4,NDUFB6基因只有1个转录本,对第一外显子不在同一区域的转录本的启动子区预测,该转录本第一外显子及第一外显子上游附近形成2个CpG岛。

1.7.2BSP实验

使用DNA 提取试剂盒提取胰腺组织基因组DNA并检测,取基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化并回收。引物的设计:Ndufb6-岛1正向引物为5′-ATG GAC CTA ACA GAA TGG AGT TGA-3′,反向引物为5′-TGC TTC TTT GAA GAA AAT TTC TCC ATA AG-3′。Ndufb6-岛2正向引物为5′-CCA GAG GCT GGG CTG CTG TGA CGC CAT C-3′,反向引物为5′-GCC CCC GCG CAG GAT GTG GCC CCT GGA G-3′。对照样品是从构建的质粒中用酶切回收得到的目的片段,对照样品正向引物为5′-AGG GAG GTG AAG TAG TGG TG-3′,反向引物为5′-GGA GGA GAA GAG TGG AGG AGT-3′。PCR扩增、克隆与测序:将目标片段割胶(上海捷瑞生物工程有限公司,GK2043)纯化,连接PGH克隆载体,按照试剂盒中的产品说明书操作。采用XL10-Gold感受态转化、复苏和涂板。酶切法鉴定阳性菌落,挑取质粒送测序。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 动脉血气分析结果

缺氧组孕鼠首次缺氧1 h后进行动脉血气分析,结果发现,缺氧组孕鼠SaO2、PaO2较健康组明显下降(P<0.001),缺氧组孕鼠母体受缺氧应激出现低氧血症,但无CO2潴留、无明显酸中毒,表明妊娠期CIH模型造模成功,见表1。

表1 2组SD孕鼠的动脉血气比较

2.2 仔鼠血液指标检测结果

分娩后第2周,缺氧组仔鼠FINS、FBG、HOMA-IR均高于健康组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05),缺氧组仔鼠出现胰岛素抵抗现象,见表2。

表2 2组仔鼠分娩后第2周血液相关指标

2.3 NDUFB6蛋白表达水平

免疫组织化学结果显示,缺氧组仔鼠胰腺组织NDUFB6蛋白表达水平明显低于健康组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。Western blot检测结果显示,健康组仔鼠胰腺组织中的NDUFB6蛋白表达水平明显高于缺氧仔鼠组,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

A:健康组仔鼠;B:缺氧组仔鼠;C:统计分析图;a:P<0.05。

2.4 NDUFB6 mRNA 表达水平

qPCR检测结果显示,健康组仔鼠胰腺组织中的NDUFB6 mRNA 水平明显高于缺氧组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

2.5 NDUFB6基因启动子区域甲基化测序及结果

2.5.1NDUFB6基因启动子CpG岛1区域甲基化分析

用Diagram对比图来表示健康组仔鼠与缺氧组仔鼠NDUFB6基因启动子CpG岛1区域甲基化率。缺氧组仔鼠NDUFB6基因CpG岛1的甲基化率和健康组仔鼠比较差异无统计学意义(χ2=0.042,P=0.967),见表3、图4。

黄色代表甲基化,蓝色代表未甲基化。

表3 2组仔鼠胰腺中NDUFB6基因启动子CpG岛1区域甲基化率

2.5.2NDUFB6基因启动子CpG岛2区域甲基化分析

用Diagram对比图来表示健康组仔鼠与缺氧组仔鼠样本NDUFB6基因启动子CpG岛2区域甲基化率。缺氧组仔鼠NDUFB6基因CpG岛2的甲基化率高于健康组仔鼠,差异有统计学意义(χ2=7.349,P<0.001),见表4、图5。

黄色代表甲基化,蓝色代表未甲基化。

表4 2组仔鼠胰腺中NDUFB6基因启动子岛2区域甲基化率

3 讨 论

一些专家学者曾经提出在胚胎发育阶段,不良环境可能使该生物体在成年阶段更易患慢性代谢性等疾病。多年来的流行病学的调查研究丰富了这个假说。人类个体的生命周期跨度大,因实验条件、医学伦理、经费等因素制约,临床研究相对比较困难。产前缺氧是临床实践中胚胎发育阶段最重要的、最常见的刺激,很多孕期不良症状及产后婴儿病理状况与宫内缺氧关系密切,如哮喘、吸烟、母体贫血、先兆子痫、胎盘功能不全等[14-15]。目前一些专家使用CIH等模型[16-17]进行相关的动物实验研究。

本研究提出母体CIH与生物体成年疾病相关的假说并进行相关研究,取得一些成果[18-20]。根据课题组成熟的动物模型[3-6,11-12],缺氧组采用的氧浓度为(10.0±0.5)%,模拟临床中的胎儿缺氧状况,孕鼠未出现CO2潴留、酸中毒现象,仅有低氧血症,仅受缺氧因素影响,说明造模成功。本研究发现缺氧组仔鼠FINS、FBG、HOMA-IR均高于健康组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05 ),说明缺氧组仔鼠出现胰岛素抵抗现象。

糖尿病具有明显遗传倾向、以血糖升高为特征,但是占糖尿病人群90%的T2DM发病的分子机制仍未明确。许多人把T2DM易感基因定位在不同染色体区域,认为其是高度复杂异质性的多基因疾病[21-22]。有研究表明中国华东地区的汉族人群患T2DM的易感基因定位于9号染色体短臂和D9S171连锁的9p21区域[23],其选择的基因NDUFB6位于该基因的连锁区域,基因表达的蛋白为线粒体还原型辅酶Ⅰ(NADH)脱氢酶家族之中的一员,蛋白、糖和脂肪的生物氧化过程都与之有关。

有研究报道,随着年龄增长,NDUFB6 基因在人体骨骼肌中的表达呈下降趋势;NDUFB6基因启动子区的单核苷酸多态(rs629566,A/G)可促使甲基化状态改变,该基因在骨骼肌中的表达下降[24]。有研究提示,短期的运动刺激能显著改善个体胰岛素敏感性,NDUFB6基因参与调节了这种适应[25-27],这一发现表明NDUFB6基因参与了线粒体功能,有助于ATP合成,表明应重视T2DM中线粒体中NDUFB6基因的作用。

本研究免疫组织化学和Western blot检测结果均提示缺氧组仔鼠胰腺组织NDUFB6蛋白表达水平明显低于健康组仔鼠(P<0.05);qPCR检测结果提示健康组仔鼠胰腺组织NDUFB6 mRNA 水平明显高于缺氧组仔鼠(P<0.05)。依据NCBI记录,NDUFB6基因只有1个转录本,对NDUFB6基因第一外显子不在同一区域的转录本的启动子区预测,该转录本第一外显子及第一外显子上游附近形成2个CpG岛;用BSP检测胰腺NDUFB6基因启动子区域位点甲基化修饰情况,结果表明缺氧组仔鼠NDUFB6基因CpG岛1区域的甲基化率和健康组仔鼠无明显差异(P>0.05),但缺氧组仔鼠NDUFB6基因CpG岛2的甲基化率高于健康组仔鼠(P<0.05)。推测CIH时仔鼠胰腺线粒体基因NDUFB6甲基化率升高,导致NDUFB6 mRNA 和蛋白表达水平下降,缺氧组仔鼠出现胰岛素抵抗现象。综上所述,CIH可致缺氧组仔鼠胰腺NDUFB6基因表观遗传机制改变,可能参与CHI区域后仔鼠胰岛素抵抗的发生、发展过程。