丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中间体缩合反应工艺∗

2024-01-05余丽丽张怡心胡娅琪

化工科技 2023年3期

余丽丽,谭雄,2,张怡心,2,胡娅琪,杨宽,秦蓓∗∗

(1.西安医学院药学院药物研究所西安市多靶协同抗高血压创新药物研制重点实验室,陕西西安 710021;2.成都医学院药学院,四川成都 610500)

高血压是一种复杂的的心血管综合症,是具有多因素、多通路、多靶点的生物网络性疾病,其发病机制复杂、治疗较为困难[1]。普利类抗高血压药物属于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类抗高血压药物,是临床采用的一线药物[2]。临床应用发现普利类药物可引起干咳、肾衰竭、血管性水肿等副作用[3],降低或者避免副作用是普利类药物开发的要点。丹参素具有脑保护、心肌保护、肝保护、肾脏保护、血管保护等活性,且能与血管紧张素转化酶活性中心的锌离子络合,实现协同降压[4]。冰片具有抗炎、抗心肌缺血、芳香开窍、促小分子的透膜吸收的作用,能够提高药物的生物利用度[5]。据此,在组合中药分子化学的策略下,前期研究证实基于以上理论设计筛选出来的普利母核候选化合物(丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯)具有良好的降压功效,能够实现脏器保护。

丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路线见图1[6-7],其中涉及了5种中间体的合成。

图1 丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路线

其中,Boc-L-脯氨酸冰片酯和Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中间体的合成属于缩合反应。为提高工业化生产的可行性,作者对中间体Boc-L-脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成工艺进行重点研究,为丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的工业化生产奠定基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DCM、DMF、四氢呋喃(THF)、二甲基亚砜(DMSO)、三氯氧磷(POCl3)、三乙胺(TEA):分析纯,天津市恒兴化学试剂公司;Boc-L-脯氨酸(Boc-L-Pro)、Boc-L-丙氨酸(Boc-L-Ala)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、EDCI、DMAP、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(Py BOP)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA):分析纯,纯度≥99%,上海阿拉丁公司;冰片、丹参素:西北大学。

高效液相色谱仪:Agilent 1260,三重四级杆质谱:Agilent 6460,美国安捷伦公司;核磁共振波谱仪:AVANCE Ⅲ(400MHz),德国瑞士Bruker公司;旋转蒸发仪:N-1210,真空干燥箱:VOS-210C,日本RIKAKIKAI EYELA;紫外分析仪:ZF-7N,上海嘉鹏科技;磁力加热搅拌器:HJ-2A,常州国华电器;电子分析天平:FA224,上海舜宇恒平科学仪器。

1.2 丹参素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成过程中缩合反应方法

1.2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯的合成

常压,在烧瓶内分别加入150 m L PCM、DMF、THF等溶剂,加入冰片充分溶解后,加入Boc-L-脯氨酸,溶解完全后加入缩合剂,反应一定时间,通过薄层色谱(TLC)检测反应是否完全。通过紫外、碘熏、茚三酮显色剂、香草醛显色剂等多种方式进行TLC显色检测。待反应完全后,加入乙酸乙酯(10 m L),用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,水相用乙酸乙酯萃取3次,合并有机相,用饱和碳酸氢钠、蒸馏水、w(HCl)＝10%水溶液、饱和氯化钠洗涤有机相,用无水硫酸钠干燥后,浓缩、真空干燥后,称量,计算产率。

1.2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成

称取一定量的化合物5,分别加入PCM、DMF、THF等溶剂,搅拌使Boc-L-脯氨酸冰片酯充分溶解。再加入Boc-L-丙氨酸,溶解后加入缩合剂,反应一定时间,TLC 监控反应。加入少量乙酸乙酯后,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。水相用乙酸乙酯萃取3~4次,合并有机相,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3 次,蒸馏水洗涤1 次,w(HCl)＝10%水溶液洗涤3 次,饱和氯化钠水溶液洗涤2次。洗涤后用无水硫酸钠干燥、浓缩、真空干燥后,称量,计算产率。

2 结果与讨论

2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯合成工艺优化

2.1.1 缩合剂种类和用量的考察

采用1.2.1的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸、冰片以及选定的2种缩合剂的物质的量比为1∶1∶1∶1,如果是一种缩合剂,则物质的量之比为1∶1∶1,V(反应溶剂)∶m(Boc-L-脯氨酸)为1∶6 ml/g,固定反应时间为6 h,考察缩合剂种类对实验的影响,实验结果见表1。

表1 缩合剂种类对化合物5合成产率的影响

由表1可知,单独使用缩合剂EDCI,产率较低,通过TLC发现体系复杂、杂质含量多,这是因为羧酸被EDCI活化后形成的中间体不稳定,易转化为副产物脲,通常可以加入催化剂如DMAP、HOBT 等能形成相对稳定的活性中间体,进而实现羧酸与醇的缩合酯化[8]。实验以EDCI 与DMAP为复合缩合剂,发现反应的处理和纯化相对容易,反应产率高,体系的杂质较少。此外,实验还考察了EDCI和HOBT组合、EDCI和TEA组合及DMAP,发现均不能得到反应的目标产物。实验还通过POCl3将羧酸转化成酰氯后与醇反应生成酯[9-10],同时加入有机碱作为缚酸剂促使反应正向进行。由表1可知,POCl3参与的反应虽然能够进行,但是产率较低,最终确认EDCI、DMAP为最优缩合剂。

考察了缩合剂n(EDCI)∶n(DMAP)的对反应产率的影响,结果见图2。

图2 缩合剂比例对化合物5产率的影响

由图2可知,随着EDCI投入量逐渐加大,反应产率表现出先上升后下降趋势,n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1反应产率最高,为98.5%。

2.1.2 反应溶剂的考察

据文献[12]报道,常用于酯缩合反应的溶剂有DCM、DMF、THF 等非质子型溶剂,因此将以上溶剂及其混合溶剂作为考察溶剂。实验固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片物质)＝1∶1,缩合剂n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1,n(反应溶剂)∶n(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,反应时间为6 h,考察不同反应溶剂对实验的影响,结果见图3。

图3 溶剂对化合物(5)产率的影响

由图3可知,以DCM 作为溶剂,反应产率最高,可达85.08%,TLC结果显示杂质较少。而以DMF、THF、DCM＋DMF、DCM＋THF、DMF＋THF为反应溶剂,产物中杂质较多,产率较低。因此确定DCM 为最优反应溶剂。

2.1.3 反应物投料比和反应时长的考察

缩合剂n(EDCI)∶n(DMAP)＝1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 mL/g,反应时间为6 h,考察n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)对反应的影响,结果见图4。由图4a可知,n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)＝1.2∶1,产率最高,为97.55%。

图4 反应物投料比和反应时间对化合物(5)产率的影响

固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)∶n(EDCI)∶n(DMAP)＝1∶1∶1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,考察了反应时间对产率的影响,结果见图4b。由图4b可知,随反应时间的增加,目标物产率逐渐增大,当t＝5 h产率趋于平稳,因此确定最佳反应时间5 h。

2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成工艺优化

2.2.1 缩合剂的考察

酰胺化反应较难发生,需加入缩合剂促进反应进行,常见的缩合剂有EDCI、鎓盐类缩合剂等。其中,EDCI属于碳二亚胺类缩合剂,在多肽生产中应用较为广泛,但在进行片段缩合时,易导致消旋,所以通常与DMAP、HOBT 一起使用,以抑制消旋化[11]。鎓盐类缩合剂活性较高,常用的有HATU、HBTU、PyBOP等,其中PyBOP活性最高,一般在其他方法不反应时使用[11-12],而HATU 活性高于HBTU。DIPEA 则常用作碱配合鎓盐类缩合剂来催化反应。实验采用1.2.2的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸冰片酯、Boc-L-丙氨酸、2种缩合剂的物质的量之比为1∶1∶1∶1,V(反应溶剂)∶m(Boc-L-丙氨酸)＝12∶1 m L/g,控制反应时间为6 h,对以上的几种缩合体系进行了筛选,结果见图5a。

图5 缩合剂种类和缩合剂用量对化合物8产率的影响

由图5a可知,实验选择的几种常用缩合体系产率均高于80%的,EDCI和DMAP的组合的产率最高,超过90%,实验过程中,综合考察了TLC监控结果和原料的成本等各方面问题,确定EDCI/DMAP为最优缩合体系。

此外考察了EDCI/DMAP 的比例对产率的影响,结果见图5b。由图5b 可知,发现随着EDCI投入量逐渐加大,反应产率表现出先上升后下降趋势,n(EDCI)∶n(DMAP)＝3∶1反应产率最高,为92.1%。

2.2.2 反应溶剂的考察

以DMAP/EDCI为缩合剂时,常采用的溶剂有DCM、DMF、THF、DMSO,固定n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)∶n(DMP)∶n(EDCI)＝1∶1∶1∶3,V(溶剂)＝16 m L,t＝6 h,考察常规溶剂及其溶剂之间的混合使用对反应的影响,结果见图6。

由图6可知,以上6种情况反应均能够顺利进行,并且产率均高于到80%,其中在V(DCM)∶V(DMF)＝1∶1,混合溶剂中产率最高,为97.02%,因此确定其为最佳反应溶剂。

2.2.3 反应物投料比和反应时长的考察

固定缩合剂n(DMAP)∶n(EDCI)＝1∶3,反应溶剂为16 m L DCM 和DMF 混合溶剂,t＝6 h。反应物投料比和反应时间对化合物8产率的影响见图7。

图7 反应物投料比和反应时间对化合物8产率的影响

由图7a可知,反应物投料比对产率具有显著的影响,主要表现为随着Boc-L-丙氨酸量的增加,产率先增后减,n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)＝1∶1.1产率最高,为97.23%,为最佳投料比。研究发现n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)分别为1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4时均出现显著的低极性杂质。由图7b可知,产率随着时间推移逐渐增大,t＝6 h后趋于平稳,产率超过97%,故最佳反应时间为6~7 h。

2.3 结构表征

通过核磁共振氢谱和质谱对化合物Boc-L-脯氨酸冰片酯5、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8的结构进行表征。

Boc-L-脯氨酸冰片酯5:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ4.95~4.80(m,1 H,f),4.23(ddd,J＝38.3,8.6,2.9 Hz,1 H,e),3.56~3.26(m,2 h,b),2.43~2.02(m,2 h,d),1.93~1.79(m,4 H,g,c),1.73~1.59(m,2 h,g),1.39(s,3 H,a),1.36(s,6 h,a),1.26~1.12(m,2 h,g),0.92(ddd,J＝17.2,14.0,3.4 Hz,1H,g),0.84(d,J＝5.9 Hz,3 H,h),0.80(d,J＝4.8 Hz,3 H,h),0.76(d,J＝6.1 Hz,3H,h)。化合物5的相对分子质量为351.5,质谱检测获得m/z＝725.70,为(2M＋Na),相对分子质量符合。

Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d),δ4.98(ddd,J＝10.1,3.4,2.0 Hz,1 H,h),4.58(dd,J＝8.8,3.7 Hz,1 H,f),4.55~4.40(m,1H,d),3.79~3.59(m,2H,a),2.36(tt,J＝9.8,4.1 Hz,1H,c),2.30~2.22(m,1 H,c),2.05(tdd,J＝12.1,7.9,3.1 Hz,3 H,b,g),1.90(ddd,J＝14.5,9.9,4.4 Hz,1H,b,g),1.80~1.69(m,2 H,b,g),1.45(s,9 H,j),1.38(d,J＝6.8 Hz,3H,i),1.29(dt,J＝7.2,3.8 Hz,2 H,g),1.10~0.94(m,1 H,g),0.91(s,3 H,e),0.89(s,3 H,e),0.83(s,3H,e)。化合物8的相对分子质量为422.6,质谱检测获得m/z＝423.40,为(M＋1),相对分子质量符合。