袁洛花，李文丽，刘海兵，范嘉佳，彭中华，邹剑

1 四川大学华西医院耳鼻咽喉头颈外科，成都 610041；2 四川省妇幼保健院耳鼻喉科

鼻咽癌是一种发生于鼻咽部黏膜上皮的恶性肿瘤，其早期症状不典型且发病部位比较隐匿，早期很难被发现，大多数患者就诊时已进展至中晚期［1］。尽管在过去几十年里，放化疗技术取得了很大进步，但鼻咽癌患者5 年生存率仍然较低［2］。肿瘤复发或转移是鼻咽癌预后不佳的重要原因。随着医学分子生物学不断发展，高效低毒的分子靶向治疗成为晚期恶性肿瘤的重要治疗手段。因此，探索鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制对于开发新的靶向治疗策略至关重要。微小RNA-498（miR-498）是近年发现的一种内源性非编码小分子RNA，定位于人染色体19q13.41。有研究表明，miR-498 在多种恶性肿瘤组织或细胞中异常表达，其异常表达与肿瘤细胞的无限增殖、侵袭和迁移密切相关［3-4］。据此推测，在鼻咽癌细胞中亦可能存在miR-498 异常表达情况，并且其异常表达与鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为有关。但迄今为止鲜见miR-498 在鼻咽癌中作用的报道。2022 年6 月—2023 年6 月，本研究探讨了miR-498 过表达对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化（EMT）的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人永生化鼻咽上皮细胞系NP69及人鼻咽癌细胞系CNE-2Z、CNE-1、HNE-1、SUNE-1，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。miR-498 mimics、阴性对照mimics（NC mimics），购自上海吉玛制药技术有限公司。ABI 7500实时荧光定量PCR 仪，购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；多功能酶标仪，购自瑞士Tecan 公司；Transwell 小室，购自美国BD 公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，购自日本TaKaRa 公司；CCK-8，购自江苏碧云天生物技术有限公司。兔抗人高迁移率族蛋白A2（HGMA2）、上皮型钙黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（Fibronectin）、GAPDH 一抗以及HRP 标记的羊抗兔IgG二抗，购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞筛选 将CNE-2Z、CNE-1、HNE-1、SUNE-1细胞接种于含10% FBS 的RPMI 1640 培养基，将NP69 接种于含10% FBS 的K-SFM 培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。每3 天更换1 次培养基。当细胞生长至70%左右融合时，0.25%胰蛋白酶消化、计数，按1∶3传代。

取传3 代、对数生长期细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，经鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit 说明，将总RNA 逆转录合成为cDNA。逆转录条件：50 ℃ 45 min，85 ℃5 min。以cDNA 模板，按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ说明进行PCR 扩增。引物序列：miR-498 上游引物5'-AAGCCAGGGGGCGTTT-3'、下游引物5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'，U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反应体系共25 µL：cDNA 模板2 µL，2 × SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 µL，上下游引物各1 µL，无酶水8.5 µL；反应条件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s 共40 个循环。PCR 扩增反应在ABI 7500 实时荧光定量PCR仪上完成。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-498相对表达量。选择miR-498 相对表达量最低的鼻咽癌细胞进行后续实验。

1.3 细胞转染 取传3代、对数生长期鼻咽癌细胞，以每孔1 × 105个接种于12 孔板，随机将细胞分为miR-498 mimics组和NC mimics组，每组设6个复孔。然后置于细胞培养箱常规培养，待细胞生长至70%左右融合时，按Lipofectamine3000 说明，miR-498 mimics 组、NC mimics 组分别转染miR-498 mimics、NC mimics。转染6 h 更换含10% FBS 的RPMI 1640培养基继续培养24 h，收集细胞。采用RT-qPCR 法验证转染效率，具体步骤参照1.2。

1.4 细胞增殖活性检测 采用CCK-8 法。收集两组上述转染细胞，按每孔1 × 105个接种于96 孔板，然后置于细胞培养箱常规培养。分别于培养0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8 溶液10 µL，继续培养3 h。酶标仪于450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD450值代表细胞增殖活性。

1.5 集落形成能力检测 采用平板克隆形成实验。收集两组上述转染细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用含10% FBS 的RPMI 1640 培养基重悬，制成密度为1 × 105/mL单细胞悬液。然后将细胞悬液接种于细胞培养皿，每皿500 个，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养14 天。隔日更换一次培养液。当培养皿中出现肉眼可见的细胞集落时，吸弃培养液，多聚甲醇固定，结晶紫染色，拍照观察。光镜下计数集落形成数目。

1.6 细胞侵袭和迁移能力检测 ①细胞侵袭能力检测：用基质胶包被Transwell 小室上室，4 ℃静置过夜。收集两组上述转染细胞，用无血清的RPMI 1640 培养基重悬制成密度为1 × 105/mL 细胞悬液，在Transwell 小室上室加入细胞悬液200 µL，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培养基600 µL。然后将小室置于细胞培养箱常规培养。培养24 h，取出小室，轻轻拭去上室面未穿膜细胞，10%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，封片，倒置显微镜下拍照观察。②细胞迁移能力检测：Transwell小室上室无需基质胶包被，其余操作同细胞侵袭能力检测。

1.7 HMGA2、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin 表达检测 采用Western blotting 法。收集两组上述转染细胞，加入细胞裂解液冰上充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。然后加入5 × 上样缓冲液，沸水浴中充分变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离，然后将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入HMGA2（稀释比1∶1 000）、E-cadherin（稀释比1∶500）、Vimentin（稀释比1∶1 000）、Fibronectin（稀释比1∶1 000）、GAPDH（稀释比1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBS 溶液洗膜，加入HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗（稀释比1∶10 000），室温孵育1 h。ECL 发光，暗室内显影、曝光，凝胶成像仪拍照，Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料经Kolmogorov-Smirnov 检验符合正态分布，以-x±s表示，结果比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞筛选结果 CNE-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1、NP69 细胞miR-498 相对表达量分别为0.54 ± 0.14、0.39 ± 0.10、0.26 ± 0.08、0.50 ±0.11、0.99 ± 0.05。CNE-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1细胞miR-498 相对表达量均低于NP69 细胞（t分别为7.415、13.145、18.954、9.933，P均＜0.05）。选择miR-498 相对表达量最低的人鼻咽癌细胞系CNE-2Z进行后续实验。

2.2 转染效率验证结果 miR-498 mimics 组与NC mimics 组miR-498 相对表达量分别为5.45 ± 0.19、1.03 ± 0.05。miR-498 mimics 组miR-498 相对表达量高于NC mimics组（t=55.107，P＜0.05）。

2.3 两组细胞增殖活性和集落形成能力比较两组培养不同时间细胞增殖活性比较见表1。miR-498 mimics 组与NC mimics 组集落形成数目分别为（76 ± 12）、（145 ± 24）个，miR-498 mimics 组集落形成数目低于NC mimics组（t=6.299，P＜0.05）。

表1 两组培养不同时间细胞增殖活性比较（±s）

表1 两组培养不同时间细胞增殖活性比较（±s）

组别细胞增殖活性（OD450值）培养0 h 0.62 ± 0.09 0.43 ± 0.08 3.865＜0.01 NC mimics组miR-498 mimics组t P培养24 h 1.30 ± 0.18 0.71 ± 0.11 6.851＜0.01培养48 h 2.57 ± 0.23 1.39 ± 0.14 10.735＜0.01培养72 h 3.84 ± 0.32 2.59 ± 0.22 7.885＜0.01

2.4 两组细胞侵袭和迁移能力比较 细胞侵袭实验时，miR-498 mimics 组与NC mimics 组穿膜细胞数分别为（99 ± 18）、（187 ± 33）个，miR-498 mimics 组穿膜细胞数低于NC mimics 组（t=5.734，P＜0.01）；细胞迁移实验时，miR-498 mimics 组与NC mimics 组穿膜细胞数分别为（126 ± 23）、（212 ± 31）个，miR-498 mimics 组穿膜细胞数低于NC mimics 组（t=5.457，P＜0.01）。

2.5 两组HMGA2、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin表达比较 见表2。

表2 两组HMGA2、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin表达比较（±s）

表2 两组HMGA2、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin表达比较（±s）

组别NC mimics组miR-498 mimics组t P HMGA2 1.13 ± 0.15 0.18 ± 0.07 14.058＜0.01 E-cadherin 0.51 ± 0.09 1.06 ± 0.11 9.479＜0.01 Vimentin 1.01 ± 0.10 0.21 ± 0.09 14.566＜0.01 Fibronectin 1.19 ± 0.18 0.30 ± 0.14 9.560＜0.01

3 讨论

鼻咽癌是头颈部常见的一种恶性肿瘤，其发生主要与遗传易感性、环境因素以及EBV 病毒感染等有关。鼻咽癌早期症状不典型，不容易被发现，大多数患者确诊时已进展至中晚期，远处转移概率较高，这也是导致其治疗失败的重要原因。随着医学分子生物学不断发展，高效低毒的分子靶向治疗成为晚期恶性肿瘤的重要治疗策略。但鼻咽癌发生、发展的分子机制尚不完全清楚。因此，探索鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制，对于开发新的靶向治疗策略具有重要意义。

miRNA 能够与靶基因mRNA 的3'端非编码区特异性结合，通过降解或抑制翻译过程调控靶基因的表达，从而参与包括肿瘤在内的多种生物学效应。在鼻咽癌中已经发现多种异常表达的miRNA，这些异常表达的miRNA 可能与鼻咽癌的发生、发展密切相关［5］。RUAN 等［6］研究报道，miR-3650 在鼻咽癌组织中表达显著上调，其表达上调与肿瘤进展和预后不良呈正相关。LI等［7］研究发现，miR-141-3p在鼻咽癌细胞中表达显著上调，miR-141-3p 可能通过靶向NME1基因调控肿瘤细胞的恶性生物学行为。但至今尚未发现在鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移中起关键性作用的miRNA。因此，深入探究miRNA 在鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用机制意义重大。近年研究报道，miR-498 在结肠癌［8］、肝细胞癌［9］、食管癌［10］等恶性肿瘤细胞中表达下调，具有抑癌作用。但迄今为止鲜见miR-498在鼻咽癌中作用的报道。

本研究结果发现，miR-498 在鼻咽癌细胞中的相对表达量明显低于永生化鼻咽上皮细胞，提示miR-498 在鼻咽癌中可能亦发挥抑癌作用。无限增殖、侵袭性生长和远处转移是恶性肿瘤细胞最基本的特征。在对其他恶性肿瘤细胞的研究中发现，miR-498 异常表达与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关。例如，WANG 等［8］研究发现，miR-498 过表达能够明显抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡；LI等［9］研究发现，miR-498过表达能够显著抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，延缓细胞周期进程；在食管癌细胞中也发现，miR-498 过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，减少肿瘤细胞集落形成数目［10］。为了观察miR-498 过表达对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响，本研究通过脂质体转染法成功上调了鼻咽癌细胞miR-498 表达。结果发现，在培养0、24、48、72 h 时，miR-498 mimics 组细胞增殖活性均低于NC mimics 组；miR-498 mimics 组集落形成能力以及细胞侵袭和迁移能力均低于NC mimics组。与以往miR-498 在其他恶性肿瘤细胞中的研究结果一致［8-10］，提示miR-498 过表达能够抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。

EMT 是上皮细胞失去上皮表型并获得间质表型的过程，与肿瘤生长、侵袭、转移以及治疗抵抗密切相关［11］。EMT 激活是肿瘤细胞获得恶性表型的关键，而miRNA 是EMT 中的重要调控因子［12］。然而，目前尚不清楚miR-498 是否能够参与调控鼻咽癌细胞的EMT。本研究结果发现，上调miR-498 表达后，鼻咽癌细胞上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白表达明显升高，而间质细胞标志物Vimentin、Fibronectin蛋白表达明显下降，提示miR-498过表达对鼻咽癌细胞EMT具有抑制作用。

miRNA 的生物学功能与其所调控的靶基因功能密切相关［13］。目前，miR-498 在鼻咽癌中的下游靶基因尚不清楚。近期研究发现，miR-498 能够靶向HMGA2 基因调控肿瘤细胞的恶性生物学行为［14-15］。HMGA2 属于高迁移率族蛋白超家族成员，在胚胎组织和多种恶性肿瘤组织中高表达，在正常组织中几乎不表达或低表达［16］。研究发现，HMGA2在鼻咽癌组织中高表达，并且其高表达与病情进展和预后不良有关［17-18］。有研究报道，抑制鼻咽癌细胞HMGA2 表达则能抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT［19-21］。本研究结果发现，上调miR-498表达后，鼻咽癌细胞HMGA2表达明显下降，提示miR-498过表达可能通过靶向调控HMGA2 表达而抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，鼻咽癌细胞miR-498低表达；miR-498过表达则能抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及EMT，其机制可能与靶向调控HMGA2表达有关。