陈琴，张志云，石西南，万春平，朱云婴，娄龙，徐瑞

1 昆明市中医医院肛肠科，昆明 650011；2 云南中医药大学基础医学院；3 云南中医药大学第一附属医院中心实验室

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性非特异性结直肠炎症性疾病，随着病情发展，有可能癌变为结直肠癌（CRC）。这种“炎-癌”转化形成的CRC 被称为结肠炎相关性结直肠癌（CAC），也是CRC 的一个重要亚型。有研究认为，炎症性肠病是CAC 发生的重要危险因素［1-2］。因此，阻止“炎-癌”转化对预防CAC的发生至关重要。微小RNA（miRNA）是一类非编码单链小RNA 分子，可在转录后水平上调控基因的表达，能够参与包括肿瘤在内的许多病理生理过程。有研究报道，miRNA 介导的转录后调控机制可参与CAC 的发生、发展，并且能够通过靶向关键miRNA 的表达来预防CAC［3］。miR-34a-5p是miR-34家族成员之一，具有抑制肿瘤作用。有研究报道，miR-34a-5p 在CRC 细胞中表达下调，而其过表达则能抑制CRC 细胞的增殖和迁移［4］。白细胞介素6（IL-6）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路是与炎症反应有关的重要通路之一，在CRC 的发生、发展中起着至关重要的作用［5］。小檗碱（BBR）是从中药黄连中提取的一种有效成分，具有多种药理作用，如抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等［6］。但目前BBR 对UC 中miR-34a-5p 表达和IL-6/STAT3 信号通路的影响尚不清楚。2022年12月—2023年5月，本研究基于IL-6/STAT3信号通路探讨了miR-34a-5p过表达对UC的影响及BBR的干预作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌HT-29细胞，由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。BBR，购自上海源叶生物科技有限公司。miR-34a-5p mimics 及其阴性对照（NC mimics），购自江苏凯基生物技术股份有限公司。实时荧光定量PCR仪，购自美国ABI公司；全波长酶标仪，购自中国赛默飞世尔科技有限公司；全自动化学发光/荧光图像分析系统，购自上海天能科技有限公司。Lipofectamine 3000、TRIzol，购自美国Invitrogen 公司；cDNA 第一链合成试剂盒、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ，购自北京宝日医生物技术有限公司；CCK-8试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；IL-6、STAT3、GAPDH 一抗，购自美国Abcam 公司；HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗，购自美国CST公司。

1.2 细胞培养 将HT-29 细胞接种于含10% FBS、青链霉素双抗的McCoy's 5A完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。每2天更换1次培养基。待细胞生长至80%～90%融合时，胰蛋白酶消化、计数，按1∶3传代。取传3代、对数生长期、生长状态良好的HT-29细胞进行后续实验。

1.3 miR-34a-5p过表达对HT-29细胞的影响

1.3.1 细胞转染 取传3 代、对数生长期、生长状态良好的HT-29 细胞，按1 × 105个/孔接种于24 孔板，用含10% FBS 的McCoy's 5A 完全培养基培养。随机分为空白对照组、NC mimics 组、miR-34a-5p mimics 组，每组设3 个复孔。当细胞生长至70%～80%融合时，按Lipofectamine 3000 说明，NC mimics组和miR-34a-5p mimics 组分别转染NC mimics、miR-34a-5p mimics。于Opti-MEM培养基中转染6 h，更换为含10% FBS 的McCoy's 5A 完全培养基继续培养48 h。收集细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，按cDNA 第一链合成试剂盒说明将总RNA 逆转录合成为cDNA。以cDNA 为模板，按TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ说明进行PCR 扩增。引物序列：miR-34a-5p 上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3'、下游引物5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'，U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反应体系共20 µL：2 × SYBR Green Realltime PCR Master Mix 10 µL，cDNA模板1 µL，上下游引物各1 µL，DEPC 水7 µL；反应条件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 min共40个循环。PCR反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.3.2 细胞活力检测 采用CCK-8法。收集各组转染后细胞，接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，每孔加入CCK-8溶液20 µL，37 ℃孵育2 h。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD450值代表细胞活力。

1.3.3 培养上清液IL-6、IL-1β、TNF-α含量检测 采用ELISA 法。收集各组转染后培养液，离心留取上清液，按IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒说明检测IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.3.4 细胞IL-6、STAT3 表达检测 ①细胞IL-6、STAT3 mRNA 表达检测：采用RT-qPCR 法。引物序列：IL-6 上游引物5'-CTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGT-3'、下游引物5'-TTTGTACTCATCTGCACAGCTC-3'，STAT3 上游引物5'-CGGAGAAGCATCGTGAGTGAGC-3'、下游引物5'-TGTTGCCGCCTCTTCCAGTCA-3'，GAPDH上游引物5'-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3'、下游引物5'-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3'。具体步骤参照1.3.1。②细胞IL-6、STAT3蛋白表达检测：采用Western blotting法。收集各组转染后细胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取细胞总蛋白。经BCA法蛋白定量合格，然后加入上样缓冲液，100 ℃水浴变性。取适量变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。10% 脱脂牛奶室温封闭30 min，分别加入IL-6、STAT3、GAPDH 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST 洗膜后加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h。TBST 洗膜后，ECL 发光，暗室内曝光、显影。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.4 BBR对UC细胞miR-34a-5p表达及IL-6/STAT3信号通路的影响

1.4.1 UC 细胞模型构建 取传3 代、对数生长期、生长状态良好的HT-29 细胞，接种于培养皿，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养12 h，加入10 ng/mL LPS 刺激48 h，建立UC 细胞模型［7］。

1.4.2 BBR浓度筛选 收集上述细胞，接种于96孔板，分别加入0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 µg/mL BBR 干预24 h。然后，每孔加入CCK-8 溶液20 µL，37 ℃孵育2 h。酶标仪于450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值。选择不引起细胞活力显著降低的BBR最高浓度进行后续实验。

1.4.3 培养上清液IL-6、IL-1β、TNF-α含量检测 采用ELISA 法。收集上述UC 细胞，接种于6 孔板，随机分为模型组和BBR组，然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长至75%以上融合时，BBR 组予BBR 干预，模型组不予BBR 干预。干预24 h，收集两组培养液，离心留取上清液，按IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒说明检测IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.4.4 细胞miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表达检测 取两组上述干预24 h 细胞，采用RT-qPCR法检测miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表达。具体步骤参照1.3。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 9.0统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk 检验符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-34a-5p过表达对HT-29细胞的影响

2.1.1 转染效率验证结果 空白对照组、NC mimics组、miR-34a-5p mimics 组miR-34a-5p 相对表达量分别为1.00 ± 0.06、1.05 ± 0.04、46.06 ± 2.25，miR-34a-5p mimics 组miR-34a-5p 相对表达量高于NC mimics 组和空白对照组（P均＜0.05），NC mimics组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.1.2 各组细胞活力比较 空白对照组、NC mimics组、miR-34a-5p mimics 组细胞活力分别为1.74 ±0.02、1.77 ± 0.03、1.47 ± 0.05，miR-34a-5p mimics组细胞活力低于NC mimics 组和空白对照组（P均＜0.05），NC mimics 组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.1.3 各组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较 见表1。

表1 各组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（pg/mL，±s）

表1 各组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（pg/mL，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与NC mimics 组比较，#P＜0.05。

TNF-α 19.59 ± 0.46 19.20 ± 0.70 17.28 ± 0.74*#组别空白对照组NC mimics组miR-34a-5p mimics组IL-1β 22.96 ± 0.42 22.67 ± 0.38 19.15 ± 0.54*#IL-6 15.33 ± 0.45 15.50 ± 0.40 13.97 ± 0.42*#

2.1.4 各组IL-6、STAT3表达比较 见表2。

表2 各组IL-6、STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较（±s）

表2 各组IL-6、STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与NC mimics组比较，#P＜0.05。

组别IL-6 STAT3空白对照组NC mimics组miR-34a-5p mimics组蛋白0.79 ± 0.02 0.78 ± 0.03 0.77 ± 0.02 mRNA 1.00 ± 0.08 1.10 ± 0.10 0.73 ± 0.05*#蛋白0.79 ± 0.02 0.76 ± 0.01 0.68 ± 0.04*#mRNA 1.00 ± 0.09 1.23 ± 0.11 0.71 ± 0.06*#

2.2 BBR对UC细胞miR-34a-5p表达及IL-6/STAT3信号通路的影响

2.2.1 BBR 浓度筛选结果 0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 µg/mL BBR 干预24 h UC细胞活力分别为1.78 ± 0.06、1.78 ± 0.03、1.78 ± 0.05、1.77 ±0.05、1.74 ± 0.02、1.59 ± 0.01、1.27 ± 0.0、1.07 ±0.01、0.80 ± 0.02。40、80、160、320 µg/mL BBR 干预24 h UC 细胞活力均高于0、2.5、5、10、20 µg/mL BBR干预24 h UC细胞（P均＜0.05）。故选择20 µg/mL BBR进行后续实验。

2.2.2 两组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较 见表3。

表3 两组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（pg/mL，±s）

表3 两组培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别模型组BBR组TNF-α 29.11 ± 1.24 23.06 ± 0.55*IL-1β 38.06 ± 0.59 27.98 ± 0.79*IL-6 25.75 ± 0.90 18.12 ± 0.49*

2.2.3 两组miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表达比较 见表4。

表4 两组miR-34a-5p以及IL-6、STAT3 mRNA相对表达量比较（±s）

表4 两组miR-34a-5p以及IL-6、STAT3 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别模型组BBR组STAT3 2.03 ± 0.04 1.16 ± 0.03*miR-34a-5p 0.51 ± 0.01 4.42 ± 0.12*IL-6 17.08 ± 0.36 1.93 ± 0.12*

3 讨论

目前，全球大约有1 120 万人受炎症性肠病困扰，并且这一数字仍在持续增长［8-9］。UC 作为一种常见的慢性非特异性结直肠炎症性疾病，其病程长、易复发且难以完全治愈。UC 所引起的持续炎症状态能够增加CAC 的发生风险。CAC 形成通常遵循典型的“炎症-非典型增生-癌变”路径，即“炎-癌”转化，而炎症性肠病则是CAC 形成的始动因素。因此，及早阻断“炎-癌”转化对预防CAC至关重要。

目前，UC 的发病机制尚未完全明了，可能与遗传倾向、免疫系统异常、肠道菌群失调等因素有关［10］。miRNA 是一类单链形式的内源性非编码单链小RNA 分子，在进化上高度保守。有研究认为，miRNA 是包括CRC 在内诸多恶性肿瘤发生、发展的关键因子［11］。miR-34a-5p 是一种具有抑癌作用的miRNA，可通过直接靶向与肿瘤发生、发展相关的多个基因，如细胞周期调控因子、凋亡抑制因子和上皮间质转化调控因子等，从而发挥抗肿瘤作用。有研究报道，miR-34a-5p 在CRC 组织中表达下调［12-13］。IL-6/STAT3 信号通路在炎症性肠病至结直肠癌变过程中起关键作用［14］，阻断此通路是防止“炎-癌”转化的一个重要策略［15］。因此，深入研究miR-34a-5p对IL-6/STAT3 信号通路的调控作用及其在炎症性肠病至结直肠癌变中的影响，对理解CAC 的发病机制和开发新的治疗方法具有重要意义。

BBR 是从中药黄连中提取出来的一种生物碱，具有多种生物学作用［6］。最近研究发现，BBR可减轻硫酸葡聚糖钠引起的小鼠结肠炎［16］，其作用机制可能包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等［17］。有研究认为，BBR延缓UC炎症反应可能是通过抑制IL-6/STAT3/NF-κB信号通路来实现的［18］。在CRC 治疗中，BBR 也展现出了多种功能，如调节细胞信号通路、促进细胞凋亡、调控miRNA表达、减轻氧化应激和调控炎症反应等［19］。然而，在UC中BBR对miR-34a-5p表达以及对IL-6/STAT3信号通路的影响尚不完全清楚。

本研究基于IL-6/STAT3 信号通路探讨了miR-34a-5p 过表达对UC 的影响及BBR 的干预作用。结果显示，miR-34a-5p 过表达能够抑制HT-29细胞活力，降低培养上清液IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，并下调IL-6、STAT3 表达。提示miR-34a-5p 过表达能够通过抑制IL-6/STAT3 信号通路减轻UC 炎症反应，miR-34a-5p有可能是治疗UC的关键靶点。进一步研究发现，BBR 能够显著降低培养上清液IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，抑制炎症反应；同时，BBR 还能显著提高miR-34a-5p 表达，抑制IL-6、STAT3 活化。提示BBR 可能是通过上调miR-34a-5p 表达和抑制IL-6/STAT3信号通路来发挥抗UC作用。

综上所述，miR-34a-5p 过表达能够通过抑制IL-6/STAT3 信号通路减轻UC 炎症反应；BBR 则能通过上调miR-34a-5p 表达和抑制IL-6/STAT3 信号通路，减轻UC 炎症反应，阻延UC 癌变。这一发现为UC 治疗提供了新的思路和药物选择，尤其对于控制炎症反应和预防CAC 发生具有重要意义，今后需进一步探索BBR在临床治疗中的应用效果。