易玉柳 陈浩, 刘翔 周丽 易菲 李蕊 刘玉红 温金华 （.江西中医药大学 南昌 0004；. 江西中医药大学附属医院 南昌0006；.南昌大学第一附属医院 南昌 0006）

八味固本化湿降脂方由党参、炒白术、盐泽泻、绿萝花各12 g，金钱草、炒决明子、荷叶各15 g，红曲9 g 组成，为临床经验方，拟制成中药制剂。方中党参有补中益气、补脾益肺等功效，加上炒白术有健脾利水、益气燥湿的作用［1］。《金匮要略方义》有记载泽泻与白术两药并用，既重祛湿，又重健脾，盐泽泻有利水渗湿、化浊降脂的功效，可助白术健脾加渗湿缓泻［2-4］，金钱草利湿消肿，与白术共为臣药。药效学研究结果显示，决明子、红曲均能降低动物血清血脂水平，荷叶、绿萝花能升清化湿［5-6］。全方从整体上对脾虚湿阻型单纯性肥胖患者情志、气机、中焦进行调理，诸药同用有化湿降脂之功效。现对八味固本化湿降脂方君药中的党参炔苷，臣药中的槲皮素以及在降脂减肥中起到主要作用的荷叶碱、银椴苷、橙黄决明素进行含量测定，并采用正交试验确定最佳煎煮条件，为制剂的质量控制、药效学实验以及临床用药安全性提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪美国Waters 公司（型号：Waters 2695）；电子分析天平、十万分之一天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司（型号：AE240）；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司（型号：RKQ-500E）；旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂（型号：E-52A/52AA）。

1.2 试药

1.2.1 药物 药材饮片均由江西古汉精制中药饮片有限公司提供。党参产自甘肃，其来源于桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根；炒白术产自安徽，其来源于菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.干燥根茎的加工品；金钱草产自四川，其来源于报春花科植物过路黄Lysimachia christinaeHance.的干燥全草；荷叶产自湖南，其来源于睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶；红曲产自福建，其来源于曲酶科真菌紫色红曲霉Monascus purpureusWent.的菌丝体及孢子经人工培养，使菌丝在粳米部生长，使整个米粒变成红色而形成的红曲米；盐泽泻产自四川，其来源于泽泻科植物泽泻Alisma planta goaquaticaLinn.的干燥块茎的加工品；炒决明子产自河北，其来源于豆科植物钝叶决明Cassia obtusifoliaL.的干燥成熟种子的加工品；绿萝花产自西藏，其来源于瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn.的干燥花蕾。上述药材经江西中医药大学药学院付小梅教授鉴定均为正品，符合相关标准。见表1。

1.2.2 对照品 银椴苷（批号：IY302951，纯度≥98%）、橙黄决明素（批号：KY240621，纯度≥98%）、党参炔苷（批号：DL120031，纯度≥98%）、荷叶碱（批号：AL40311，纯度≥98%）、槲皮素（批号：QL103929，纯度≥98%），均购自合肥博美生物有限公司。

1.2.3 试剂 甲醇（批号：40Y2209FP，美国默克）、乙腈（批号：12Y2208FH，美国默克）、磷酸（批号：H2212477，上海阿拉丁）、纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 汤剂制备

参考《医疗机构中药煎药室管理规范》以及《中药饮片标准汤剂研究策略》中煎煮汤剂的制备方法［7-8］，取八味固本化湿降脂方一个处方量102 g，由党参、炒白术、盐泽泻、绿萝花各12 g，金钱草、炒决明子、荷叶各15 g，红曲9 g 组成。前期的临床研究发现荷叶需要久煎效果更佳，在此基础上荷叶选择先煎煮30 min。炒制过的决明子以及由红曲霉与粳米发酵而成的中药红曲，在多次实验中发现煎煮15 min 为最佳煎煮条件。煎煮浓缩至药液约100 mL，倒出药液趁热滤过，纯净水定容至100 mL。

2.2 色谱条件

色谱柱为WAT054275 Symmetry C18（4.6 mm×250 mm），5 μm；流动相为乙腈（B）-0.1%磷酸（A）；梯度洗脱设置为0～20 min，5%～10%乙腈；20～30 min，10%～15%乙腈；30～50 min，15%～18%乙腈；50～65 min，18%～20%乙腈；65～76 min， 20%～22%乙腈；76～80 min，22%～30%乙腈；80～95 min，30%～ 50%乙腈；95～105 min，50%～70% 乙腈；105～115 min，70%～80% 乙腈。进样量为10 µL；流速为1.0 mL/min；检测波长设定为300 nm。在上述条件下，目标峰可以完全分离，混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。

图1 混合对照品及供试品溶液色谱图

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品制备 取“2.1”项下得到的汤剂5 mL，离心10 min（4 500 r/min），1.5 mL 一次性针管吸取离心管中的上清液，过微孔滤膜，供试品溶液备用。

2.3.2 混合对照品制备 精密称定对照品荷叶碱0.000 82 g、党参炔苷0.002 10g、槲皮素0.000 77 g、银椴苷0.004 96 g、橙黄决明素0.001 43 g，10 mL甲醇溶解，配制浓度为82、210、77、496、143 µg/mL的混合对照品溶液制备。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”中对照品溶液，稀释至1、2、4、8、16、32 倍，即可以得到一系列的混合对照品溶液，其中荷叶碱质量浓度梯度为82、41、20.5、10.25、5.125、2.562 5 µg/mL，党参炔苷质量浓度梯度为210、105、52.5、26.25、13.125、6.562 5 µg/mL，槲皮素质量浓度梯度为：78、39、19.5、9.75、4.875、2.437 5 µg/mL，银椴苷质量浓度梯度为496、248、124、62、31、15.5 µg/mL，橙黄决明素质量浓度梯度为：144、72、36、18、9、4.5 µg/mL。分别按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，记录色谱峰峰面积。以5 个对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果表明5 个对照品在各自范围内线性关系良好。见表2。

表2 各成分线性回归方程

2.4.2 仪器精密度试验 精密吸取“2.3.2”中对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，重复测定6 次，记录色谱峰峰面积，计算RSD值。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、橙黄决明素、银椴苷谱峰峰面积的RSD分别为1.08%，0.80%，1.05%，0.58%，1.10%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 方法重复性试验 按照“2.3.1”项下供试品制备方法平行制备6 份，采用“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素色谱峰相对峰面积RSD分别为1.00%，1.29%，1.35%，1.22%，1.01%，结果显示方法重复性良好。

2.4.4 溶液稳定性试验 按照“2.3.1”项下制备供试品溶液，采用“2.2”项下色谱条件，将制得的供试品溶液室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样，记录色谱峰峰面积。测得荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素面积的RSD分别为1.04%，1.93%，1.94%，1.82%，1.76%，结果显示八味固本化湿降脂方放置室温24 h 内稳定性良好。

2.4.5 回收率试验 取已知指标成分含量汤剂供试品样品2.5 mL，精密量取6 份，分别置10 mL 容量瓶中，容量瓶1～6 号瓶中依次加入制备好的相同浓度的混合对照2.5 mL，混合均匀后，过微孔滤膜，即得到回收率实验的供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图并分析，分别计算荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素平均加样回收率分别为99.76%，99.76%，99.44%，101.95%，100.97%；RSD分别为2.41%，2.98%，3.21%，2.81%，2.78%，结果表明该方法具有良好的回收率。

2.5 工艺研究

2.5.1 实验设计 为确定八味固本化湿降脂方最佳煎煮方法，在查阅中药煎煮相关文献的基础上，对其煎煮条件进行3 水平3 因素的考察。除去荷叶考察，其余7 个药材的加水倍数，分别以6、7、8 倍水；各个药材浸泡时间为30、40、60 min；除去先下后下的药材，考察剩余5 个药材的煎煮时间，分别为20、30、40 min。见表3。

表3 因素水平表

2.5.2 正交实验结果 根据正交试验结果分析，得到本方最佳煎煮条件为A2B3C2，即八味固本化湿降脂方饮片加水量为7 倍，浸泡时间为60 min，煎煮时间为30 min。最终确定本品的制备工艺为：取荷叶12 倍纯净水浸泡60 min，煮沸后文火先单独煎煮30 min，再取党参、炒白术、金钱草、盐泽泻、绿萝花7 倍纯净水浸泡60 min，煎煮时间为30 min，后取红曲、炒决明子7 倍纯净水浸泡60 min，煎煮15 min，趁热过滤后收集药液。二煎加7 倍纯净水，再次煮沸后文火煎煮30 min，药液倒出趁热过滤，将2 次煎煮液均过滤后收集在同一个容器中，采用抽滤机进行负压浓缩，用纯净水定容至100 mL。见表4。

表4 正交试验结果

根据实验结果，采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，结果表明煎煮时间P＜0.05，为显著性因素，而加水倍数与浸泡时间无显著性。见表5。

表5 方差分析结果

2.5.3 最佳工艺验证 为确定最佳工艺的可行性，称取八味固本化湿降脂方3 份，按照上述工艺下提取供试品溶液3 份，按照“2.2”项下色谱条件进行试验，记录色峰面积谱图，计算八味固本化湿降脂方中荷叶碱、党参炔苷、槲皮素、银椴苷、橙黄决明素的含量，3 组试验各指标的RSD均小于3%，表明工艺合理可行。见表6。

表6 试验验证结果 μg/mL

3 讨论

中药复方汤剂的煎煮方法对临床疗效有很大的影响［9］，因此对中药复方汤剂提取工艺的控制非常重要。但目前中药汤剂质量检测方法与标准制定还不够完善，固在药效学实验研究之前进行标准汤剂工艺研究是非常必要。本试验结果符合《中药饮片标准汤剂研究策略》［10］中提到的2～8 倍的水为根茎类药材的加水量，而蓬松的叶类药材加水量更多，因此本试验研究选择了荷叶浸泡时加12 倍水，而其余药材根据正交实验结果，统一为7 倍水，浸泡时间为60 min，煎煮时间为30 min，即可提取药材的大部分有效成分。本试验通过以指标性成分含测及正交试验设计等评价方法为临床汤剂的质控提供了一定的实验依据，该方法对于临床煎煮汤剂起到质控作用。

对八味固本化湿降脂方含量进行了测定，在190～400 nm 范围内对待测标准品溶液进行了全波长扫描，综合考虑各方面因素，最终确定300 nm为此次实验的检测波长。

在流动相方面，考察了甲醇-水、乙腈-0.5%磷酸水2 种流动性梯度的洗脱结果，在乙腈-0.5%磷酸水基础上又调整成了乙腈-0.1%磷酸水，结果显示乙腈-0.1%磷酸水的分离效果最好，因此本次实验选择乙腈-0.1%磷酸水为检测的流动相系统。

中药饮片标准汤剂作为临床制剂的标准参照物，是为了保障用药准确性和一致性的重要部分［13］，也是为开发中药制剂做的前期准备。本实验规范了八味固本化湿降脂方的煎煮工艺过程，确保了用药的准确性和疗效的一致性，为进一步开发成中药制剂打下坚实基础。