王杰 李强 张磊 邵静茹 王甜甜 程彦 张心声 张雪芹 房云海△

(1.山东省血液中心山东省血友病诊疗中心,山东 济南 250014,2.济南市中心医院,3.山东大学齐鲁儿童医院)

血友病A 为凝血因子Ⅷ缺乏的X 染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,而凝血因子Ⅺ缺乏为常染色体隐性的遗传出血性疾病。在遗传性凝血因子缺乏症中,缺乏凝血因子Ⅷ、Ⅸ的血友病A 及血友病B 相对常见,与血管性血友病(VWD)构成了95%～97%的遗传性出血性疾病,其他的遗传性凝血因子缺乏占3%～5%[1],包括遗传性纤维蛋白原缺乏症、凝血酶原缺乏症、FⅤ缺乏症、FⅤ和FⅧ联合缺乏症、FⅦ缺乏症、FⅩ缺乏症、FⅪ缺乏症、FⅧ缺乏症以及维生素K 依赖性凝血因子缺乏[1-2]。我们报道的1 例患儿APTT 延长,经过凝血因子检测发现患儿不仅是FⅧ∶C 降低,同时还伴有FⅪ∶C 降低,诊断为血友病A 伴凝血因子Ⅺ减少症,我们对其进行基因分析,探究其发病机制,并进行文献复习。

1 资料与方法

1.1 病历资料 患儿,男,1 岁2 月,因“发现右侧阴囊空虚1年”于2022 年11 月就诊于山东大学齐鲁儿童医院,完善相关检查,血常规示WBC:12.23×109/L,RBC:4.32×1012/L,血小板计数:340×109/L,血凝五项示凝血酶原时间PT:12.8 s,活化部分凝血活酶时间APTT:64.2 s,凝血酶时间:18.2 s,纤维蛋白原2.66 g/L,D-二聚体0.27 mg/L,生化全项未见异常,血型为O 型阳性,既往史:患儿家属否认有出血史。患者因术前发现凝血异常送检至本中心进行凝血因子检测,查体:右侧阴囊扁平空虚,内无睾丸,于该侧腹股沟上段扪及一睾丸样肿物,大小约1.0×0.6 cm,质软,活动度较小,不可牵拉至阴囊内,拟手术行腹腔镜下行睾丸固定术。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 采集患儿及父母血样各2 管,1 管为0.109 mol/L(3.2%)的枸橼酸钠1 ∶9 抗凝的全血2 mL,4℃低温1 500 g 离心15 min 得到乏血小板血浆进行凝血指标检测,另1 管EDTA 抗凝的静脉全血用于基因检测,患儿及家属均已签订知情同意书,审批号为鲁血伦审字【2022】10 号。

1.2.2 凝血指标检测 采用CS2000i 全自动凝血分析仪检测患者的凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ∶C)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ∶C)、狼疮抗凝物,采用Bethesda 法检测FⅧ抑制物及FⅪ抑制物,ACLTOP300 全自动凝血分析仪检测VWF ∶Ag。

1.2.3 基因检测 由北京智因东方转化医学研究中心进行基因检测,提取患儿及其父母的DNA,并对FⅧ、FⅪ基因进行筛查,发现其突变位点。

1.2.4 生物信息学分析 使用SWISS-MODEL 网站(https:/ /swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质三维结构构建,使用Mega软件进行蛋白质序列的比对,在NCBI 数据库下载不同物种的FⅪ基因的蛋白序列(详细信息如下:Homo sapiens XP＿005262878.1,Pan troglodytes XP＿009446984.1,Macacamulatta XP＿014995138.1,Equusquagga XP＿046504759.1),对突变蛋白的保守性进行分析。

2 结果

2.1 凝血检测 患儿FⅧ∶C 为10.1%,FⅪ∶C 为35.6%,其他凝血因子均正常。父母凝血因子检测均为正常,见表1。

患儿父亲母亲参考范围FⅧ10.1102.3 110.250～150 FⅨ59.9123.1 105.750～150 FⅪ35.698.462.350～150 FⅫ52105.385.450～150 VWF ∶Ag86.1152.7 125.6O 型42.0～140.8 A/B/AB 型66.1～176.3 FⅧ抑制物(BU)0000～0.6 FⅪ抑制物(BU)0000～0.6狼疮抗凝物1.10.91.1<1.2

2.2 基因检测 经测序发现患者FⅧ存在c.1834(exon12)C>T 突变,根据ACMG 指南(2019)此突变为可能致病突变,母亲为杂合突变,父亲为野生型,同时FⅪ存在c.1817(exon15)G>A 杂合突变导致了FⅪ第606 位的甘氨酸突变为天冬氨酸(Gly 606Asp)。通过NCBI 数据库(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)对该位点进行查询,发现在人群中并没有该位点突变的数据,排除基因多态性的可能。检索突变数据(http:/ /www.geht.org/databaseang/fibrinogen)及查阅文献显示,该突变类型为国际尚未见报道的新突变。

2.3 生物信息学分析结果 SWISS-MODEL 建模中发现,当Gly606 突变为Asp 后,羧基数目增加1 个(图1)。蛋白同源性分析发现,Gly606 在哺乳类动物、爬行类和两栖类等多种脊椎动物中均有较高的保守性(图2)。

图2 FⅪGly606 同源型物种间高度保守

3 讨论

血友病A 在男性中的患病率为1/5 000[3],而凝血FⅪ缺乏既往被称为血友病C,是1 种常染色体的隐性遗传性疾病,现在改称先天性FⅪ缺乏症,男女均可发病,患病率为1/100 万,在罕见性遗传性出血性疾病中患者数仅少于血友病、VWD 和先天性FⅦ缺乏症[2]。血友病的出血表型与其因子含量呈相关性,绝大多数患者凝血因子水平越低,出血表现越重,重型血友病A 常见的出血部位多为自发性的关节肌肉血肿,轻型血友病多表现为重大外伤或手术后出血[4]。而FⅪ减少的出血表现与因子含量不成正相关,出血表型主要与损伤位置相关,相对于血友病患者轻微。

本研究中发现患儿PT 正常,APTT 延长,因此只对其内源性凝血因子进行检测同时对患儿及其父母的FⅧ、FⅪ基因测序结果进行分析,患儿母亲为血友病A 的携带者,也携带了先天性FⅪ缺乏症的突变基因,同时我们对FⅧ、FⅪ的突变位点进行了检索(https:/ /www.disgenet.org/search),发现FⅧ的突变位点是已报道的致病突变,而FⅪ此位点的突变信息未被报道。

此位点的突变使患儿FⅪ基因15 号外显子突变(c.1817G>A)导致甘氨酸变为天冬氨酸(p.G606D),提示该位点可能是患儿FⅪ减少的原因。多序列比对结果显示,该位点涵盖了哺乳动物类、两栖动物类和爬行动物类在内的所有脊椎动物的分类中均为保守位点,同时查阅了NCBI 数据库中该位点的群体遗传学数据,在世界多种人群中均无该位点多态性的报道,提示该位点在进化中为1 个高度保守的位点,其正确的结构和功能非常重要,突变后势必会对凝血功能造成影响,蛋白质同源建模结果显示,该位点突变后,由甘氨酸变为天冬氨酸,增加了羧基的数目。

同时,本例血友病A 伴FⅪ减少症的患儿通过二代测序证实,此突变位点自母亲遗传而来,并且通过生物信息学分析,证实了FⅪ突变位点(c.1817(exon15)G>A)是造成FⅪ活性降低的原因。FⅪ是常染色体隐性遗传性疾病,该患儿是突变位点的携带者,表现为凝血因子Ⅺ减少。而患儿母亲同为FⅪ此突变位点的携带者,但FⅪ∶C 在正常范围,可能主要与其母亲目前正处于妊娠晚期高凝状态有关。

回顾近年来国内外关于罕见凝血因子缺乏的文献,凝血因子缺乏是1 种罕见疾病,2 种凝血因子合并缺乏更加罕见,1 种以上凝血因子缺乏叫做家族性多重凝血因子缺乏症(FMCFDs)[5],而血友病A 伴FⅪ缺乏症少见。国际上曾报道过三兄弟患有FⅧ合并FⅪ缺乏,并对其家系进行分析,发现分别有FⅧ突变和FⅪ突变引起的凝血因子缺乏,与本报道的相似,且患者在经历几次手术中均有明显出血表现[6]。通过检索文献,既往报道过10 名男性患者[6-7]和1 名女性患者[8]FⅧ和FⅪ联合缺乏,Sayaka 等[9]报道过1 例FⅧ联合FⅪ减少的老年患者因心力衰竭入院进行手术治疗,在术前制定的止血方案中予以输注人凝血因子Ⅷ和新鲜冰冻血浆进行止血治疗。国内报道的联合凝血因子缺乏的病例也有,FⅤ、FⅧ联合缺乏的较多[10],维生素K 缺乏引起的获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ减少的病例也有[11]。但血友病A 伴凝血因子Ⅺ减少的病例很少,以单个凝血因子缺乏症居多,例如FⅪ缺乏症,FⅪ基因位于第4 号染色体的长臂(4q35)上,长度为50 kb,包含15 个外显子和14 个内含子。根据FⅪ突变数据库,目前已发现多达220 个突变[12]。国内叶佳佳等[13]研究发现Cys482Trp 使FⅪ重要结构域缺失及作用力改变形成不稳定蛋白,可能导致FⅪ活性下降。Kankan Su等[14]的研究在国际上首次报道发现Tyr503Cys 突变,替换产生了半胱氨酸残基,导致形成额外的氢键和二硫键,影响了FⅪ蛋白的结构和功能,导致FⅪ活性降低。国际上,也有大量的文献表明氨基酸的变化可引起蛋白质的三维构象发生变化,从而导致蛋白质中氨基酸相互作用力的改变并影响其功能。

在临床工作中,血友病A 伴先天性FⅪ减少的患者非常罕见,因此在临床上容易造成漏诊,若遇到APTT 相关的多项因子缺乏时,需要排除干扰APTT 检测的因素如获得性血友病、狼疮抗凝物阳性等。有报道[15]发现,高滴度的血友病A 伴抑制物和获得性血友病A,会出现Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子均降低的现象,但随着稀释倍数到1 ∶2和1 ∶4,凝血因子Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ都明显升高,更接近患者的真实水平,但凝血因子Ⅷ的值则变化不大,考虑Ⅷ抑制物,因此对于多个因子缺乏,稀释后,如果其余的因子都升高,只有1 个变化不大,就考虑这个因子的抑制物,同样,狼疮抗凝物强阳性患者,也会出现Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ因子均降低,将标本稀释后检测,降低狼疮抗凝物的影响,凝血因子会有明显的升高,提示这部分患者本身的凝血因子并不低,只是狼疮抗凝物影响检测。

本研究发现的血友病A 伴凝血因子Ⅺ减少症在国内属于首次报道,为保证手术的安全性,在术前为患者输注了人凝血因子Ⅷ及新鲜冰冻血浆预防术中出血,术中、术后患儿均未见出血量多于其他凝血因子正常的患者,此次手术也为后续其他病例手术开展提供了一定的参考经验。

随着临床对凝血因子缺乏症认知程度的不断提高及凝血因子检测的普及,为避免漏诊和误诊,对于APTT 延长的患者,尤其是行外科手术治疗前,应对APTT 相关的全部凝血因子进行检测,同时需要排除干扰APTT 检测的因素如获得性血友病、狼疮抗凝物阳性等,不能确诊的患者可以进行基因检测帮助明确诊断。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。