纪淑华 林授 黄淑铭 林小枚 张宇 江伟梅 褚晓凌△

(1.福建省血液中心,福建 福州 350004,2.福建医科大学孟超肝胆医院检验科)

新型冠状病毒(SARS-COV-2)自2019 年发现以来,引起的新冠病毒感染(coronavirus disease 2019,COVID-19)迅速在全球流行,对人民生命安全造成极大威胁。迄今为止,新冠病毒感染仍无特效药,新冠病毒疫苗接种是预防的重要手段之一。接种疫苗可刺激机体产生特异性抗体,抗体通过识别、中和或杀灭入侵的新冠病毒,达到预防目的。随着接种疫苗时间的推移,中和抗体水平下降,需通过加强免疫提高抗体水平。截至2022 年12 月13 日,我国累计报告接种新冠病毒疫苗34 亿5 167.7 万剂次,疫苗接种覆盖人数和全程接种人数分别占全国总人口的92.73%和90.37%[1],其中福建省累计接种10 256.01 万人次[2]。目前来看,新冠病毒疫苗预防重症和死亡效果非常显著[3]。新冠疫苗接种后仍然会发生突破性感染,但接种新冠疫苗加强针6 个月内,对预防新冠病毒感染和症状方面是有效的[4]。2022 年12 月至2023 年2 月期间,我国超过82%的人口感染新冠病毒[4],福建省于2023 年12 月底达到新冠病毒感染高峰。新冠疫情爆发以来,全球尚无新冠病毒通过输血途径传播的报道[5],健康人群接种新冠疫苗后,可按«血站新冠肺炎疫情常态化防控工作指引(第二版)»[6]规定的间隔期正常献血。随着新冠病毒感染诊疗方案不断完善和规范,恢复期血浆可用于病情进展较快、具有高危因素的普通型以及重症、危重症新冠肺炎患者的治疗[7]。我们拟通过对福州地区无偿献血人群新冠病毒疫苗第1 剂加强免疫接种前后以及突破性感染后特异性SARS-COV-2 IgG 抗体(以下简称IgG 抗体)水平的监测,分析抗体消长特性,为进一步的新冠疫苗接种策略、新冠康复者恢复期血浆采集最佳时间及高效价的血浆用于COVID-19 特异性人免疫球蛋白的研发和生产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2021 年10—11 月从本中心献血者中招募志愿者151 名,随访至2023 年1 月。志愿者纳入标准:1)完成新冠疫苗全程免疫接种,接种疫苗类型为新冠病毒灭活疫苗,2)随访期间完成且仅完成第1 剂新冠疫苗加强免疫接种(以下简称加强免疫),3)随访期间在第1 剂加强免疫接种前、加强免疫接种后、发生新冠病毒突破性感染后分别留取血液标本1 次、6 次、1 次。志愿者排除标准:1)未能按要求留取血液标本,2)2022 年11 月31 日前感染新冠病毒。最终109 名志愿者完成本研究。本研究所有志愿者均签署知情同意书,并通过福建省血液中心伦理委员会批准(批准号LL2021001)。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 通过本中心血液管理信息系统和问卷调查,收集志愿者的年龄、性别、体重、血型、BMI、是否吸烟,新冠疫苗全程免疫、加强免疫接种的时间和类型等信息。

1.2.2 仪器与试剂 IgG 抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒(批号:20211002、k20220118、20230103),化学发光免疫分析仪(Caris200),均为厦门万泰凯瑞生物技术有限公司产品。

1.2.3 标本采集 每位志愿者共留取8 次血液标本,分别在加强免疫前14(11,20)d(记为Time0),加强免疫后14(10,23)d(记为Time1)、53(45.5,61)d(记为Time2)、88(78,101.5)d(记为Time3)、124(112.5,138.5)d(记为Time4)、158(146,174)d(记为Time5)、194(179.5,214)d(记为Time6),发生突破性感染后1 个月内(记为Time7)。血液标本采用带分离胶的EDTA-K2抗凝管留取全血8 mL。

1.2.4 IgG 抗体检测 采用化学发光免疫分析法检测IgG 抗体。IgG 抗体检测结果以S/CO 比值表示(S/CO ＝仪器检测出的样本发光值/通过校准品发光值计算出的临界值,临界值＝阳性对照发光值均值×0.1＋阴性对照发光值均值,单位为COI)。标本的检测过程、结果判定均严格按照试剂盒说明书要求,S/CO≥1COI 判定为阳性,<1 为阴性。

1.2.5 新冠病毒突破性感染调查 接种疫苗14 d 后发生感染,即突破性感染[8],结合本研究实际,以下2 种情况判定为发生突破性感染:1)2022 年12 月－2023 年1 月期间新冠病毒核酸和(或)抗原检测阳性,2)2022 年12 月－2023 年1 月血液标本IgG 抗体检测值高于加强免疫后Time1 随访检测的最高值。采用问卷调查福州地区新冠病毒大规模流行期间志愿者是否出现新冠感染相关症状及是否发热,107 名志愿者接受调查,102 名发生突破性感染。

1.3 统计学分析 采用SPSS 25.0 统计学软件进行统计学分析,计量资料符合正态分布的采用±s 表示,偏态分布的采用中位数和四分位间距M(P25,P75)表示,2 组间采用Wilcoxon 检验或Wilcoxon 符号秩和检验,计数资料采用Mc-Nemar 精确检验,计量资料采用单因素和两因素重复测量方差分析,不符合球形检验时,以一元方差分析中Greenhouse-Geisser 校正结果为准。所有统计分析均以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 加强免疫前后IgG 抗体阳性情况 全程免疫至Time0的时间为180(171,200)d,加强免疫至Time6 的时间为194(180,214)d,两者比较差异有统计学意义(P<0.05 )(表1)。51 名加强免疫前(Time0)IgG 抗体阴性者于加强免疫后14(10,23)d(Time1)转阳。所有109 名志愿者Time1～Time5标本IgG 抗体检测均为阳性,5 名于Time6 转阴。Time1 和Time6 IgG 抗体的阳性率和抗体值均高于Time0,差异有统计学意义(P<0.001)(表2)。

表1 新冠疫苗全程免疫至Time0 与加强免疫至Time6时间间隔比较

表2 新冠疫苗加强免疫前后SARS-COV-2IgG 抗体水平比较(n ＝109)

2.2 加强免疫后IgG 抗体水平变化情况 加强免疫后Time1 的IgG 抗体水平最高,此后逐月下降,Time2～Time6 水平分别为峰值的89.9%、77.7%、68.3%、59.4%、53.9%。不同性别、体重、BMI、年龄、血型、是否吸烟组同时间点的IgG 抗体水平差异无统计学意义(P值均>0.05),Time1～Time6 的IgG 抗体水平均呈下降趋势(P值均<0.001),留样检测时间与各组不存在交互效应,差异无统计学意义(P值均>0.05),(表3)。

表3 新冠疫苗加强免疫后SARS-COV-2 IgG 抗体水平变化情况(±s)

表3 新冠疫苗加强免疫后SARS-COV-2 IgG 抗体水平变化情况(±s)

重复测量方差分析组别nTime1Time2Time3Time4Time5Time6时间效应分组效应时间×分组效应F 值P 值F 值 P 值 F 值P 值性别女27 11.14±2.31 9.65±2.82 8.51±2.95 7.49±3.21 6.23±2.98 5.85±3.19 180.52 <0.001 0.00 >0.05 0.64 >0.05男82 10.74±2.53 9.77±2.89 8.39±3.18 7.37±3.40 6.51±3.47 5.84±3.66体重 <558 11.31±1.64 10.07±3.39 8.73±3.31 7.46±3.81 6.54±3.12 6.21±3.57 180.52 <0.001 0.09 >0.05 0.15 >0.05(kg) ≥55101 10.69±2.68 9.71±2.83 8.40±3.12 7.39±3.33 6.43±3.38 5.82±3.5 BMI<2438 10.51±3.03 9.69±3.16 8.59±3.26 7.67±3.53 6.79±3.26 6.02±3.64 170.28 <0.001 0.09 >0.05 1.33 >0.05≥2471 10.86±2.38 9.78±2.70 8.34±3.06 7.26±3.27 6.25±3.40 5.75±3.50年龄 <5090 11.02±2.43 9.82±2.90 8.49±3.17 7.50±3.39 6.58±3.42 6.02±3.57 136.69 <0.001 0.93 >0.05 0.73 >0.05(岁) ≥5019 9.97±2.55 9.39±2.69 8.10±2.91 6.92±3.13 5.79±2.95 5.02±3.31血型A32 10.90±2.46 10.05±2.99 8.83±3.31 7.74±3.47 7.09±3.66 5.96±3.77 182.54 <0.001 0.47 >0.05 0.71 >0.05 B23 11.00±2.47 9.79±2.97 8.18±3.51 7.14±3.74 6.36±3.55 5.86±3.77 O43 10.98±2.27 9.71±2.75 8.40±2.85 7.42±3.16 6.27±3.06 6.05±3.47 AB11 9.76±3.29 10.71±2.85 7.84±2.94 6.88±3.14 5.36±3.06 4.66±2.73吸烟否84 10.87±2.40 9.81±2.83 8.54±3.08 7.53±3.37 6.58±3.34 6.06±3.45 178.5 <0.001 0.61 >0.05 0.92 >0.05是25 10.74±2.75 9.53±2.99 8.00±3.25 6.95±3.26 5.79±3.38 5.11±3.76总计 109 10.84±2.47 9.74±2.86 8.42±3.11 7.40±3.34 6.44±3.35 5.84±3.53 234.47 <0.001//

2.3 突破性感染后IgG 抗体与加强免疫后峰值水平比较52 名志愿者核酸和(或)抗原检测阳性,另有50 名未进行核酸或抗原检测,但所有102 名志愿者2022 年12 月－2023 年1月期间IgG 抗体值均高于加强免疫后的峰值(即Time1,2.07倍),判定为发生突破性感染。接受调查的志愿者95.3%发生突破性感染,突破性感染者76.5%出现症状,均为轻型,包括发热、头痛、全身疼痛、乏力、咳嗽、鼻塞、流鼻涕、味觉减退等,50%出现发热。Time7 与Time1 IgG 抗体水平差异有统计学意义(P<0.001)(表4)。突破性感染无症状组与有症状组、无发热组与发热组Time7IgG 抗体水平差异无统计学意义(P值均>0.05)(表5)。有无突破性感染组Time7IgG 抗体水平差异有统计学意义(P<0.001)(表6)。

表4 突破性感染后SARS-COV-2 IgG 抗体与加强免疫后峰值的比较

表5 有无症状与发热者突破性感染后SARS-COV-2 IgG抗体值的比较

表6 有无发生突破性感染者SARS-COV-2 IgG 抗体比较

3 讨论

新冠病毒为β 属冠状病毒,病毒颗粒中包含4 种结构蛋白:刺突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrane,M)以及核壳蛋白(nucleocapsid,N)。COVID-19疫苗设计和开发的主要靶点是SARS-COV-2 的棘突(spike,S) 蛋白[9],S 蛋白的受体结合域(receptor binding domain,RBD)可通过诱导中和抗体阻止宿主与病毒的相互作用[10]。有研究发现[11],IgG 抗体效价及免疫动态变化与中和抗体相似,SARS-CoV-2 受体结构域特异性IgG 抗体与中和抗体滴度呈正相关[12-13],可用于体外评价中和抗体。本课题通过监测新冠病毒S 蛋白受体结构域的SARS-COV-2 IgG 抗体水平,作为研究新冠病毒疫苗免疫保护效果的参考指标。

本研究中的109 名志愿者,加强免疫前IgG 抗体阴性的51 名(46.8%),于新冠疫苗加强免疫后Time1IgG 抗体均转阳,阳性率100%,较赵本南等和张雪梅等[14-15]报道的接种加强针后1 个月的阳性率高(分别为94.5%和75.9%),结果不同可能与本研究志愿者均为健康献血者、标本数、留样时间、IgG 抗体检测试剂与方法等因素有关。本研究结果显示,加强免疫后Time1IgG 抗体水平达到峰值(10.84±2.47),此后逐月下降,Time2 ～ Time5 抗体水平分别为峰值的89.9%、77.7%、68.3%、59.4%。加强免疫后194(180,214)d(Time6)仅5 名(4.6%)IgG 抗体转阴,阳性者IgG 抗体水平仍达峰值的53.9%,阳性率(95.4%)和抗体值(5.84±3.53)均高于全程免疫后180(171,200)d[分别为53.2%和(1.69±1.56)]。Liu等[16]研究发现,接种第2 剂灭活疫苗后5 个月抗体水平降至低值,但接种者体内仍可检测到特异性记忆B 细胞和T 细胞,接种第3 剂后体内快速产生大量特异性CD4＋T 及CD8＋T 细胞,中和抗体也在接种第3 剂后1 周达到高值,与本研究结果相似。抗体的产生过程分为潜伏期、对数期、平台期和下降期[17],加强免疫接种后Time1 达到抗体水平平台期,Time2～Time6 进入下降期,与葛文娟等[18]研究结果相同。

本研究对不同性别、体重、BMI、年龄、血型和是否吸烟志愿者的分组结果显示,加强免疫后Time1～Time6 同时间点IgG 抗体水平基本相同,各分组因素对IgG 抗体表达无明显影响,留样检测时间与各组不存在交互效应,随着时间推移,抗体下降幅度也大致相同(表3)。刘梦颖等[11]报道,接种第2 剂新冠病毒灭活疫苗后30 d,不同性别、年龄、是否吸烟等组间IgG 特异性抗体水平基本相同,表明对于第2 剂和第3 剂(即加强免疫)病毒灭活疫苗,不同性别、年龄和是否吸烟等因素都不影响抗体表达,但体质量会对IgG 的表达有影响,低体质量组更易产生高滴度的IgG,与本研究结果存在差异,可能与体重分组标准不同有关(刘梦颖[11]等将体重按40～<60 Kg、60～<80 Kg、80～≤100 kg 分3 组,本研究按48～<55 kg 和≥55 kg 分2 组)。血型对于抗体水平的影响,现有研究报道各不相同。有研究发现[19-20],不同血型的新冠感染康复者SARS-CoV-2IgG 抗体滴度无显著差异,与本研究结果相同,而Hayes 等[21]发现,新冠感染康复者O 型献血者的SARS-CoV-2 IgG 抗体水平较A 型献血者低,其他血型组之间的抗体水平无差异,不同血型呈现的抗体水平差异,仍需要大样本量的研究进一步证实。

2022 年9 月26 日至2023 年2 月16 日,全国本土病例新冠病毒基因组有效序列,均为奥密克戎变异株[22]。本研究102 名突破性感染均为轻症和无症状者,主要表现为上呼吸道感染症状,这可能与志愿者无基础疾病、年龄相对年轻,身体素质较好,且符合«献血者健康要求»[23]的固定单采献血者有关。突破性感染后(Time7)IgG 抗体值达到加强免疫后峰值2.07 倍,突破性感染者IgG 抗体水平高于无突破性感染者,2 组之间抗体水平存在统计学差异,提示免疫突破病例IgG 抗体滴度高于新冠疫苗免疫人群,从IgG 抗体滴度来看,免疫突破病例相对于新冠疫苗免疫人群多了1 次加强免疫[24],推测突破性感染时,机体接触病毒抗原载量可能比疫苗接种多,一般而言,抗原载量更高往往能诱导更高的抗体滴度[25],即真正的感染往往导致更强烈的免疫应答,然而对于疫苗接种来说,可能需要多次疫苗接种才能获得完全保护性免疫[26],也反映出机体多次接受抗原暴露能够产生更强的抗体反应。此外,本研究未发现有无症状和发热的突破性感染者之间,其感染后(Time7)IgG 抗体水平存在差异,这与黄爱龙等[25]报道的无症状感染者在急性感染期以及康复期抗体水平均低于有症状患者组研究结果不同,原因有待后续进一步研究探讨。

综上,健康成年人接受第1 剂新冠病毒灭活疫苗加强免疫后2 周SARS-COV-2 IgG 抗体水平即达到峰值,此后随时间消减。突破性感染后1 月内抗体水平远高于第1 剂加强免疫后的峰值,提示病毒感染和包括疫苗接种在内的多次抗原暴露可刺激机体产生更强的免疫应答。新冠病毒疫苗接种或突破性感染1 月左右进行新冠特免血浆或康复者恢复期血浆采集为佳,采供血机构可在此时机动员感染后的献血者捐献血浆或通过筛查获得高效价血浆为临床治疗提供支持,疫苗接种者则可在此时机捐献特免血浆,为大规模生产COVID-19 特异性人免疫球蛋白提供充足原料。同时,应持续监测抗体消长情况,为后续疫苗接种相关科研提供依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。