夏志丹，张忠元

武汉市红十字会医院 药剂科，湖北 武汉 430015

木犀草素（luteolin，LUT）是从木犀草科草本植物木犀草Reseda odorataL.中提取得到的一种黄酮类化合物[1]，具有消炎、抗过敏、抗菌、抗病毒等多种生物学活性[2]。随着研究的不断深入，发现LUT 对乳腺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等肿瘤细胞具有明显抑制作用。然而，LUT 溶解度为6 μg·mL-1（37 ℃，pH 6.8）时，其较差的溶解性不利于口服吸收[6]，进而严重影响药物的临床治疗效果。近年来，研究人员将木犀草素制备成药物共晶[7]、固体脂质纳米粒[8]、固体分散体[9-10]等不同新型给药系统以提高药物的口服生物利用度。然而，这些制剂有其局限性，如共晶是否会改变药理作用尚不明确，固体脂质纳米粒存在放大生产困难、储存稳定性差等问题，固体分散体稳定性较差，久贮会发生老化现象。

胶束是由两亲性嵌段共聚物在水中溶解后自发形成的具有“核-壳结构”的高分子聚集体，可以增加药物的溶解度及渗透性，提高口服生物利用度，延长药物在血液循环中的半衰期，避免网状内皮系统的非特异性摄取，改变药物的体内药动学和组织分布，作为一种提高药物溶解度和生物利用度的有效手段已引起广大药学研究者的广泛关注[11]。为此，本研究以Pluronic F127 和Pluronic P123 作为胶束载体材料[12]，将木犀草素制备成纳米胶束（nanomicelles，NMs），并通过大鼠体内药动学评估其口服生物利用度，为进一步提高木犀草素的抗肿瘤的药用价值研究提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

K2025 型高效液相色谱仪（海能未来技术集团股份有限公司）；ZNCL-GS 型智能控温集热式水浴油浴锅（河南佰年仪器有限公司）；RE-52A 型实验室旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Zetasizer Nano ZS90 型动态光散射仪（英国马尔文公司）；JEM-2100Plus 型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；M-F24G 型高速冷冻离心机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 试药

LUT 原料药（南京广润生物制品有限公司，纯度：98.5%）；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic）F127、Pluronic P123 均购于德国巴斯夫公司；二氯甲烷（百灵威化学试剂公司）。

1.3 实验动物

无特定病原体（SPF）级SD 大鼠12 只，2～3 月龄，体质量为（200±20）g，由武汉大学实验动物中心提供[实验动物生产许可证：SCXK（鄂）2019-0004，实验动物使用许可证：SYXK（鄂）2019-0013]。本课题经武汉大学动物实验伦理委员会批准（批准号：2022030012）。

2 方法与结果

2.1 LUT-NMs的制备

使用溶剂蒸发-薄膜水化分散法制备LUT-NMs。称取不同质量比的聚合物Pluronic F127 和Pluronic P123 加入到含有二氯甲烷20 mL 的圆底烧瓶中，搅拌溶解；再称取一定质量的LUT加到上述溶液中，搅拌溶解，最终形成透明状溶液；将该溶液在45 °C水浴温度和-0.1 MPa真空度下减压蒸发挥干有机溶剂，在瓶内壁形成1层半透明状薄膜；取蒸馏水10 mL加入到烧瓶中，持续振摇直至形成半透明状混悬液，混悬液经0.22 μm 滤膜滤过，并在10 000 r·min-1高速离心10 min（离心半径为10 cm），取上清液，即得到LUT-NMs。

2.2 包封率测定

2.2.1 色谱条件 Aquasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（60∶40）；检测波长为350 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

2.2.2 线性范围 称取LUT 原料药约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加少量甲醇超声溶解，放冷至室温，加流动相至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取对照品储备液，用流动相依次稀释至0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μg·mL-1，按 照2.2.1 项下色谱条件进样分析，并以药物质量浓度（C）为横坐标，药物平均峰面积（A）为纵坐标进行线性回归拟合，得回归方程为A=28 745C-3867（r=0.999 9），表明LUT 在0.05～10.00 μg·mL-1时与峰面积线性关系良好。将对照品储备液用流动相逐步稀释，按2.2.1项下色谱条件进样分析，当信噪比约为3时确定为检测限，当信噪比约为10时确定为定量限。经测定，LUT的检测限质量浓度0.01 μg·mL-1，定量限质量浓度为0.05 μg·mL-1。

2.2.3 包封率测定 移取LUT-NMs 溶液1.0 mL 至25 mL 量瓶中，加入少量甲醇进行超声处理，破坏胶束结构，加流动相定容，样品经2.2.1 项下色谱条件检测药物含量，根据公式（1）计算包封率。每份样品测量3次，取平均值。

其中，W胶束表示包裹在胶束中的药物含量，W投药量表示投药量。

2.3 粒径及多聚分散系数（PDI）测定

取LUT-NMs 用25 ℃蒸馏水适当稀释后，使用Zetasizer Nano ZS90型动态光散射仪测定其粒径分布与PDI，在测定前样品均需在25 °C条件下平衡180 s。计算平均值及SD。

目前，武术界普遍认为“峨眉武术起源于春秋战国时期，是指峨眉山区域的峨眉山道、僧武术与民间武术且以峨眉命名的各种拳术、器械、功法和武术理论等武术内容与形式的总称”。[3]

2.4 中心复合实验设计

2.4.1 实验设计优化LUT-NMs 的处方 在前期实验过程中发现，聚合物与药物质量比（X1）、Pluronic F127 与Pluronic P123 质量比（X2）是影响LUT-NMs 的包封率（Y1）、粒径分布（Y2）和PDI（Y3）的主要因素。因此，本研究采用二因素三水平中心复合响应面法研究这2 个自变量对LUT-NMs 的Y1、Y2和Y3的影响[13]。根据前期实验确定2 个变量的范围，即X1为10∶1～50∶1，X2为1∶1～9∶1，实验设计变量见表1。共进行了11 次实验，实验安排及结果见表2。

表1 LUT-NMs中心复合实验设计变量与水平

表2 LUT-NMs中心复合实验设计方案及结果

2.4.2 模型选择 实验所得数据经中心复合实验设计软件处理，并使用线性回归拟合线性（Linear）、双因素交互作用（2FI）和多元二次模型（Quadratic）对Y1、Y2和Y3进行评估[14]，选择具有最高调整复相关系数（R2）和预测R2的模型进行判断（表3），确定Y1，Y2和Y3均采用多元二次模型进行拟合，得到的多元二次方程：Y1=1.359 0+2.256 4X1+0.955 7X2-0.021 6X1X2；Y2=82.977 6-0.869 1X1-0.534 7X2+0.009 0X1X2；Y3=0.265 1-0.002 3X1+0.000 9X2-0.000 3X1X2。通过统计分析得到2 个自变量分别与3 个因变量之间的方差分析结果，见表4；关系图见图1～图3。

图1 Y1、Y2和Y3的响应面图

图2 Pluronic F127与Pluronic P123形成的聚合物胶束临界胶束浓度（CMC）值

图3 LUT-NMs的透射电镜照片（×100 000）

表3 LUT-NMs中Y1、Y2和Y3模型拟合选择结果

表4 LUT-NMs实验数据方差分析结果

表4 方差分析表明，X1和X2对LUT-NMs 的Y1具有显著影响（P<0.05）。由响应面图1A 可知，在X1较低的条件下，药物的Y1较低，这是由于大部分药物未被胶束包载，药物会以沉淀形式析出[15]；当聚合物与药物质量比增大后，药物包封率出现明显增大趋势。在X2较高的条件下，药物的包封率增大，这是由于LUT 与疏水性较强的Pluronic F127 的亲和力高于亲水性较强的Pluronic P123，这就意味着当Pluronic F127 在聚合物中占比较高时，会有更多的药物被聚合物胶束包载[16]。

表4 方差分析表明，X1和X2对Y2具有显著影响（P<0.05）。由响应面图1B 可知，随着X1增加，Y2出现减小趋势，这是由于在聚合物胶束内部可以包载的药物较高，而减少了药物分子在胶束表面的吸附量[17]，进而促使粒径分布减小；随着X2增加，Y2出现减小趋势，这可能归因于Pluronic F127 能够形成更为紧密的胶束结构，提高了胶束空间稳定性[18]。

表4 方差分析表明，X1对Y3具有显著影响（P<0.05）。由响应面图1C 可知，增加X1会降低Y3，并有利于粒径的均匀分布（PDI降低）。

聚合物纳米胶束经口服给药后，会被完整地吸收进入体循环，因此聚合物纳米胶束的包封率高、粒径分布小且均匀就会有利于其被充分吸收[19]。因此，本研究以制备LUT-NMs的包封率最大、粒径分布和PDI 最小为目标值，经实验软件优化得到最佳处方：X1为45∶1，X2为5∶1。

2.5 性质评价

通过绘制可知，Pluronic F127 与Pluronic P123（质量比为5∶1）所形成的聚合物胶束的CMC 值为0.049 mg·mL-1，CMC 值相对较低，表明其形成的胶束具有较高的稳定性，即使在体液极度稀释后也能保持完整性[21]。

2.5.2 微观形态 取LUT-NMs 滴加到涂碳的铜网格上均匀铺展，之后在LUT-NMs 样品表面滴加1 滴质量浓度为20 mg·mL-1磷钨酸染色液，负染10 min，红外灯下干燥样品，在透射电镜下观察LUT-NMs的微观形态，见图3。透射电镜照片显示，LUT-NMs呈球形，表面光滑，分散均匀，无聚集，大多数粒径不超过50 nm。

2.5.3 稀释稳定性 为了评价LUT-NMs 在不同pH溶液中的抗稀释能力，分别用pH 1.2、4.5、6.8 缓冲液将其稀释至200 倍，在稀释后的6、12、24 h 时间点观察外观，取样检测LUT-NMs的粒径分布，评估其物理稳定性，结果见表5。

表5 LUT-NMs稀释稳定性结果（,n=3） nm

表5 LUT-NMs稀释稳定性结果（,n=3） nm

稀释稳定性实验结果显示，LUT-NMs 经pH 1.2、4.5、6.8 缓冲液稀释后24 h 内，样品均无絮凝分层，也无药物沉淀析出，粒径基本无变化，表明LUT-NMs 在不同pH 溶液中具有良好的抗稀释能力。这不仅与胶束的较低CMC相关，还可能是由于聚合物与LUT 之间存在的氢键或范德华力等作用力，可以预测LUT-NMs经口服给药进入胃肠道内可以保持完整性，并避免药物泄漏[22]。

2.5.4 体外药物释放 采用动态膜透析法考察LUT-NMs 在不同pH 介质溶液中的释药速率。分别采用pH 1.2 盐酸溶液、pH 4.5 乙酸盐缓冲液、pH 6.8 磷酸盐缓冲液作为释放介质，3 种介质溶液中均加入质量浓度为1 mg·mL-1吐温80 作为增溶剂，介质溶液体积为200 mL，水浴温度为37 ℃，磁子转速为100 r·min-1。取LUT-NMs 2 mL 加入到前处理好的透析袋（截留相对分子质量：12～14 kDa）中，系紧两端，放入到释放介质中，在预定时间点（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h）取出释放介质2 mL（并立即补充等量预热的空白介质），过滤后检测药物含量，绘制累积药物释放-时间曲线图（图4）。

图4 LUT-NMs在不同pH介质中的体外药物释放曲线（,n=6）

通过体外考察LUT-NMs 在不同pH 介质中的释药速率来评估其在体内环境中的可能的释药状态。由释放曲线可知，LUT-NMs 在不同pH 释放介质中药物释放速率基本一致，前期释药速率较快，推测是吸附在纳米胶束表面的药物释放所致；而在后期释药速率较慢，可能是包裹在胶束内部的药物通过扩散，或者载体材料溶蚀后药物释放所致。

2.6 药动学研究

采用体质量为（200±20）g 的SD 大鼠对LUTNMs 进行体内药动学研究。将大鼠随机分为A 和B两组（给药前禁食12 h），A 组大鼠灌胃给予LUT混悬液（以0.5%羧甲基纤维素钠溶液分散），B 组大鼠灌胃给予LUT-NMs，给药剂量为40 mg·kg-1，分别在给药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 从眼眶静脉丛收集血液0.5 mL 至肝素化的离心管中，经5000 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm），用移液枪分离出血浆，并在-20 °C的冰箱中冷冻。取血浆200 μL加入盐酸普萘洛尔（5 μg·mL-1）10 μL作为内标溶液，再将氢氧化钠溶液（0.5 mol·L-1）20 μL 和乙酸乙酯300 μL置于血浆样品中，涡旋混合2 min，10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm），小心收集有机相，在温和的氮气流下将有机相挥干，将干燥后的残渣用50 μL 流动相重新溶解，涡旋3 min，10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm），取上清液20 μL注入到HPLC 系统中，按2.2.1 项下色谱条件检测并计算血药浓度，低、中、高3 个药物浓度的血浆样品的精密度RSD 均小于15%，绝对回收率为85%～115%，符合生物样品分析方法指导原则规定，该方法可用于LUT 在大鼠血浆中的含量测定。使用DAS 2.0 软件拟合药动学参数，结果见表6，血药浓度-时间曲线见图5。药动学结果显示，与口服LUT悬浮液大鼠相比，口服LUT-NMs的大鼠，其达峰时间（Tmax）明显提前，药物达峰浓度（Cmax）和药时曲线下面积（AUC0-t）均显著增加，半衰期（T1/2）明显延长，生物利用度提高了2.11倍。

图5 大鼠口服LUT悬浮液和LUT-NMs后的血浆浓度-时间曲线（,n=6）

表6 LUT混悬剂和LUT-NMs经大鼠口服给药后的药动学参数（,n=6）

表6 LUT混悬剂和LUT-NMs经大鼠口服给药后的药动学参数（,n=6）

注：—表示无此项数据；#表示LUT-NMs与LUT混悬剂相比差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

普朗尼克（Pluronic）是由亲水端聚环氧乙烷（PEO）和疏水端聚环氧丙烷（PPO）组成的两亲性三嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），分为多种型号。Pluronic 已被美国FDA 批准可用于体内注射，该辅料无不良反应，在体内可生物降解，已在生命科学领域广泛应用[23-24]。以Pluronic 作为纳米胶束载体具有如下优势：1）嵌段共聚物的疏水端形成内核，可将难溶性药物包裹在其中，而亲水端外壳则保护药物免受水环境的影响；2）具有较低的CMC 值，解离速度慢，稳定性好；3）可以提高难溶性药物的生物利用度[25]。

已有多位研究人员将木犀草素制备成新型给药系统用于提高药物的口服生物利用度。例如，燕柳艳等[7]将木犀草素与哌嗪制备成共晶，改善了木犀草素溶解度和体内生物利用度，同时提高了木犀草素的成药性，然而，木犀草素制备成共晶，其药理作用是否会进一步发生改变，还有待深入研究发掘。杨娟等[8]将木犀草素制备成固体脂质纳米粒，可促进木犀草素口服吸收，提高其生物利用度，但固体脂质纳米粒促进药物吸收的程度还会受到纳米粒粒径、纳米材料性质、表面活性剂种类、纳米粒表面亲水亲脂性及空间特性、体内稳定性及跨膜吸收过程中诸多因素的影响，尚需作进一步研究。李阳杰等[9]采用溶剂挥发法将木犀草素磷脂复合物，其生物利用度提高2.09 倍，但溶解度增加不明显。邓向涛等[10]以PVP K30为载体，采用溶剂挥发法将木犀草素分别制备成固体分散体和木犀草素磷脂复合物固体分散体，2种固体分散体均可显著提高药物生物利用度，且磷脂复合物固体分散体提高更明显，但制剂制备工艺较为苛刻，需要严格控制水分进入反应体系。

本研究结果仅限于木犀草素纳米胶束（LUTNMs）的制备和初步体内外评价，后续将对LUTNMs 在动物体内的组织分布、体内安全性等进行全面研究，为其进一步的开发应用提供更完整的实验数据，有望为提高木犀草素的抗肿瘤的药用价值提供新的研究思路。