王宁宁，高岩，张梅，温秀凤，卢顺光，杨志刚*

1.兰州大学 药学院，甘肃 兰州 730030；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；3.水利部沙棘开发管理中心，北京 100058

沙棘为胡颓子科沙棘属植物，近年来研究发现，其叶具有药用价值及大健康产品开发潜力[1]。目前，沙棘叶已被批准为新资源食品[2]。沙棘叶中蛋白质类、氨基酸类、多糖类、有机酸类、黄酮类、萜类及微量元素等活性物质含量丰富[3]，尤其是具有抗炎、肝脏保护、抗氧化等活性的黄酮类功效成分含量显著高于果实[4]。但大部分沙棘叶在收获果实后被归为农业废料，未得到合理利用[5]。沙棘叶富含黄酮醇苷，主要是异鼠李素和槲皮素衍生物[6]。张小民等[7]按照食品安全性毒理学评价程序和方法，对沙棘茶叶进行了急性毒性实验，结果表明以沙棘茶叶提取物对小鼠经口灌胃，半数致死量（LD50）>10 g·kg-1（以体质量计），属无毒级物质，可作为安全的食品开发原料。沙棘有“天然营养库”的美称，其枝叶、果渣是优良的畜禽补充饲料[8-9]。以沙棘叶为原料开发的沙棘叶茶产品相关研究也较多[10]。本课题组前期研究发现，沙棘叶和沙棘叶茶中总黄酮含量丰富，主要包含以异鼠李素、槲皮素、山柰素为母核的黄酮苷类和可水解鞣质等成分，并且具有较强的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[11]。建立沙棘叶中黄酮类功效成分高效液相色谱法（HPLC）定性、定量分析方法，对沙棘叶及沙棘叶茶等相关产品的质量评价和质量控制具有积极意义。HPLC 等色谱指纹图谱技术在药品、食品质量评价和质量控制领域应用广泛[12]。本研究建立了不同产地沙棘叶HPLC 指纹图谱，采用聚类分析和主成分分析对不同产地沙棘叶质量进行评价，并测定了其中异鼠李素、槲皮素、山柰酚3 种黄酮类功效成分含量，以期为沙棘叶质量控制及其黄酮类功效成分产品开发提供参考。

1 材料

1.1 样品

2018 年9 月采集15 批沙棘叶样品，经兰州大学药学院杨志刚教授鉴定为胡颓子科沙棘属沙棘Hippophae rhamnoidesL.的叶，测试样品标本保存于兰州大学药学院。样品信息见表1。

表1 不同产地沙棘叶样品信息

1.2 仪器

EasySep-3030型液相色谱仪（包括EasySep-3030型紫外检测器、AS-2000 型自动进样器、EasySep-3030 型二元泵，上海通微公司）；BSM220.4 型电子分析天平（上海卓精科技有限公司）；SB25-12D型超声波仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 试药

对照品异槲皮苷、水仙苷（纯度≥98%，成都麦德生科技有限公司）；芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（纯度均≥98%，成都普菲德生物技术有限公司）；表没食子儿茶素、表儿茶素、槲皮素、异鼠李素、山柰酚、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯（纯度均≥98%，上海诗丹德生物科技有限公司）；沙棘宁B、英国栎鞣花酸、木麻黄鞣宁为本课题组从沙棘叶中提取分离得到，纯度均≥98%；色谱级乙腈、甲醇（德国默克公司）；其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1 指纹图谱

供试品溶液的制备：称取沙棘叶粉末约0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：色谱柱为GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～40.0 min，10%～20%A；40.1～50.0 min，20%～40%A；50.1～60.0 min，40%～80%A；60.1～73.0 min，100%～10%A）；进样量为10 μL；流速为0.8 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm。

2.2 含量测定

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品3.14、1.60、1.85 mg，分别加入甲醇配制成质量浓度为1.046 7、0.533 3、0.616 7 mg·mL-1的母液，之后用甲醇稀释成梯度质量浓度的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：称取沙棘叶样品粉末约0.50 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流30 min。精密量取续滤液25 mL，置具塞比色管中，加盐酸3.5 mL，75 °C 水浴中加热水解1 h，加甲醇定容至50 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件：色谱柱为GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（58∶42）；流速为1.0 mL·min-1；柱 温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长为370 nm。

3 结果

3.1 指纹图谱

3.1.1 方法学考察

3.1.1.1 精密度试验 样品S1按2.1项下色谱条件连续进样5 次，峰1 相对保留时间的RSD 为0.48%，相对峰面积的RSD为0.96%，表明仪器精密度良好。

3.1.1.2 稳定性试验 样品S1 在贮存0、2、4、6、12、24 h 后按2.1 项下色谱条件进行分析，峰1 相对保留时间的RSD 为0.96%，相对峰面积的RSD 为4.68%，表明样品溶液在24 h内较稳定。

3.1.1.3 重复性试验 样品S1按2.1项下方法平行制备5 份，测定，峰1 相对保留时间RSD 为0.86%，相对峰面积的RSD 为0.40%，表明该方法重复性良好。

3.1.2 指纹图谱 不同产地沙棘叶和对照品色谱图见图1。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件对15 批不同产地沙棘叶指纹图谱进行相似度分析（表2），以样品S1为参比样品，不同产地沙棘叶相似度为0.647～0.910，13批样品相似度均大于0.80，表明这些产地沙棘叶化学成分组成较为相似，产地因素对沙棘叶化学成分有一定影响；指纹图谱共有26 个共有峰，以4 号峰为参比峰，以各共有峰对4 号峰的峰面积之比为相对峰面积，得到15 批样品26 个色谱峰的标准化数据（表3）。通过和对照品tR比对共指认出9 个共有峰，其中4 号峰为英国栎鞣花酸、13 号峰为沙棘宁B、14 号峰为木麻黄鞣宁、15 号峰为表儿茶素、17 号峰为表没食子儿茶素、19 号峰为芦丁、20号峰为异槲皮苷、21号峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷、22号峰为水仙苷。

图1 沙棘叶和对照品HPLC图

表2 不同产地沙棘叶样品HPLC指纹图谱相似度

表3 沙棘叶共有峰相对峰面积

3.2 聚类分析

聚类分析将15 批不同产地沙棘叶样品聚为3 类（图2）。其中，产地为新疆的样品S5、S9、S11聚为一类；除S8 外，剩余样品聚为一类，说明这些产地的沙棘叶质量较为接近，而新疆产地的沙棘叶与其他产地的沙棘叶化学成分差异较大。

图2 不同产地沙棘叶聚类分析

3.3 主成分分析

将26 个共有峰峰面积导入SIMCA-P 14.1 软件，对所有样品进行主成分分析，除样品S8 外，沙棘叶样品被分为2 类（图3），新疆产地样品S15、S11 和S9 距离其他产地的样品较远，说明新疆产地的沙棘叶和其他产地沙棘叶成分差异较大，这与聚类分析结果一致。

图3 不同产地沙棘叶主成分分析

3.4 含量测定

3.4.1 方法学考察

3.4.1.1 线性关系考察 按2.2 项下色谱条件进样分析，以混合对照品不同质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，见表4。

表4 槲皮素、山柰酚、异鼠李素的回归方程、线性范围和r

3.4.1.2 精密度试验 样品S1按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录相对保留时间和相对峰面积，槲皮素、山柰酚、异鼠李素相对保留时间的RSD 分别为0.93%、1.68%、1.89%，相对峰面积的RSD分别为2.60%、2.82%、3.36%，表明仪器的精密度良好。

3.4.1.3 稳定性试验 按2.2项下条件制备样品S1供试品溶液，在0、2、4、6、12、24 h后进行分析，槲皮素、山柰酚、异鼠李素相对保留时间的RSD 分别为1.21%、1.80、0.33%，相对峰面积的RSD分别为2.04%、4.13%、3.22%，表明样品在24 h内稳定性良好。

3.4.1.4 重复性试验 将样品S1按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，测定，槲皮素、山柰酚、异鼠李素相对保留时间的RSD分别为1.74%、1.30%、1.35%，相对峰面积的RSD 分别为1.39%、3.32%、2.03%，表明该方法的重复性较好。

3.4.1.5 加样回收率试验 称取已知含量的沙棘叶粉末6份，每份约0.25 g，分别精密加入已知含量的异鼠李素、槲皮素、山柰酚对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2 项下色谱条件测定，记录峰面积并计算平均加样回收率，结果显示，槲皮素、山柰酚、异鼠李素的平均加样回收率分别为106.40%、103.65%、106.37%，RSD分别为2.23%、2.21%、2.79%。

3.4.2 样品测定 对不同产地沙棘叶中槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量进行测定，结果见表5。不同产地沙棘叶中槲皮素、山柰酚、异鼠李素的质量分数分别为0.12%～0.33%、0.07%～0.32%、0.10%～0.49%。甘肃产地槲皮素、山柰酚、异鼠李素的质量分数分别为0.18%～0.30%、0.13%～0.21%、0.16%～0.30%；山西产地槲皮素、山柰酚、异鼠李素的质量分数分别为0.12%～0.33%、0.09%～0.17%、0.10%～0.26%；新疆产地槲皮素、山柰酚、异鼠李素的质量分数分别为0.19%～0.27%、0.10%～0.15%、0.17%～0.49%。由此可知，产地对沙棘叶中槲皮素、山柰酚、异鼠李素含量影响较大，新疆生长的沙棘叶中异鼠李素含量较其他产地高，可能和其生长环境、采收时间等因素相关。

表5 不同产地沙棘叶中槲皮素、山柰酚和异鼠李素质量分数（,n=6） %

表5 不同产地沙棘叶中槲皮素、山柰酚和异鼠李素质量分数（,n=6） %

4 讨论

本研究建立了不同产地沙棘叶的指纹图谱，相似度及聚类分析结果表明，不同产地沙棘叶化学成分有一定差异。英国栎鞣花酸、沙棘宁B 和木麻黄鞣宁3 种共有鞣质类成分具有较强的抗炎活性和抗肥胖活性[13]。表儿茶素、表没食子儿茶素、水仙苷、芦丁、异槲皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷具有体外降血糖活性[14]。对15批不同产地沙棘叶样品中槲皮素、山柰酚、异鼠李素含量进行测定，结果表明，在不同产地样品中这3 个黄酮类成分含量差异较大。山西忻州的样品中槲皮素质量分数最高，为0.33%；内蒙古鄂尔多斯的山柰酚质量分数最高，为0.32%；新疆塔城样品中异鼠李素质量分数最高，为0.49%。这可能和沙棘生长环境、采收时间等因素相关。建议将槲皮素、山柰酚和异鼠李素作为沙棘叶及其相关产品质量控制的指标成分。