唐 毅,杨清麟,王 伟,袁 渊,丁诗华,孙翰昌 ,吕 浩

(1.西南大学 水产学院,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆 400715; 2.重庆多普泰制药股份有限公司,重庆 400800; 3.重庆文理学院 园林与生命科学学院,生态渔业产业化技术创新中心,重庆 402160; 4.重庆市合川区水产技术推广站,重庆 401520)

宽体金线蛭(Whitmaniapigra)俗称蚂蟥,隶属环节动物门蛭纲无吻蛭目黄蛭科金线蛭属[1]。在世界范围内分布广泛,在我国主要分布于吉林、山东、江苏、安徽、湖北等地的水田、沟渠、河流与湖泊等淡水水域中[2]。宽体金线蛭是近年来中药材水蛭的主要来源,其干品和鲜品均含有抗凝血活性物质,包括蛋白质、微量元素和必需氨基酸[3],起着活血化瘀、通经活络、消积散结等功效[4],临床上主要用于防治心肌梗死、脑血栓等心脑血管疾病,以及高血压、高脂血症等[5]。近年来,在一些国家和地区,养殖水蛭以满足临床和药用需求的科学兴趣与日俱增,水蛭成为新兴养殖品种之一[1]。然而,随着近年来水蛭养殖规模增大,养殖集约化程度提高造成养殖环境恶化,其病害时有发生,尤以细菌性疾病的危害更大,病蛭出现体表疥疮、肌肉腐烂、生殖腺和肠道出血等症状[6-9]。

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)是一种革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧细菌,隶属肠杆菌科柠檬酸杆菌属[10-11]。该菌广泛分布于土壤、水体和食物等自然环境中,是一种典型的人-畜-鱼共患的条件性致病菌[12],尤其在人工养殖条件下,该菌常引起多种水产动物感染发病而造成较大的经济损失。如罗非鱼(Oreochromismossambicus)暴发性死亡[13]、施氏鲟(Acipenserschrenckii)嘴部红肿病[14]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)体表溃烂症[15]、克氏原螯虾(Procambarusclarkia)烂尾病[16]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)黑鳃病[17]、巴西龟(Trachemysscripta)发病死亡[18]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)水肿病[19]等都是由弗氏柠檬酸杆菌感染所引起。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料采集

2020年5月,重庆綦江区某水蛭养殖基地的宽体金线蛭因自然患病而大量死亡,送检患有明显水肿症状的活体宽体金线蛭6条,体重(9.05±1.75)g。

1.1.2 健康水蛭

试验用宽体金线蛭购于重庆永川某水蛭养殖场,经检查其体质健壮活跃、无伤病、体重(8.6±1.5)g,共100条,盛于60目筛绢网兜并置加有冰袋的泡沫箱中运输。

1.1.3 主要试剂

普通营养琼脂培养基(NA)和营养肉汤培养基(NB)按实验室常规方法自配,细菌微量生化鉴定管、标准药敏纸片、革兰氏和荚膜芽孢染色液购自杭州微生物试剂有限公司,细菌基因组DNA提取试剂盒和2×TaqPCR Master Mix购自天根生化科技有限公司,DNA Marker购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 病原菌的分离和纯培养

取具典型患病症状的活体宽体金线蛭,用质量分数0.85%的无菌NaCl溶液冲洗体表3遍后,再用体积分数75%的乙醇擦拭消毒。无菌条件下解剖并分别进行体内外肉眼检查、显微镜和透射电镜检查,分别判断有无寄生虫、真菌和病毒感染;然后用接种环蘸取病蛭体腔液,于NA培养基划线接种,置于28 ℃恒温培养24 h后,挑取形态特征一致的优势菌落进一步划线纯化。将纯培养物接种于NB液体培养基,200 r·min-1、28 ℃恒温培养24 h,取灭菌的甘油与菌液按体积比1∶1混合后于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 观察指标 采用自制调查问卷收集两组患者临床资料，对急性缺血性脑卒中影响因素进行多因素回归分析，及其与急性缺血性脑卒中的相关性。

1.3 形态学观察

将纯化菌株命名为CQ1808并划线接种于NA平板上,置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h。观察菌落大小、形态、颜色和透明度等,并挑选单菌落进行革兰氏染色后,置于10×100倍光学显微镜下观察细菌形态。

1.4 生理生化鉴定

取CQ1808纯培养菌株接种于细菌微量生化鉴定管中,28 ℃培养24 h观察结果。同时人工补充其他相关生理生化实验,并参照《常规细菌系统鉴定手册》,以弗氏柠檬酸杆菌LMG 3246作为阳性参照菌株[20]。

1.5 分子生物学鉴定

参考产品说明书,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取CQ1808菌株的基因组DNA。以基因组DNA为PCR模板,用通用引物(27F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R,5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增该菌株的16S rDNA基因[21],引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成。PCR扩增程序为:94 ℃ 2 min;95 ℃ 3 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,对目的条带进行回收纯化并送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序所得结果用NCBI数据库中的BLAST进行同源性比对,利用MEGA 10.0软件对检索出的同源性较高的序列进行多序列匹配分析。采用邻接法(neighbor-joining method)对CQ1808菌株的16S rDNA基因进行系统发育树构建。

1.6 药敏试验

药敏试验采用K-B纸片扩散法进行,用接种针从NA平板挑取新培养的CQ1808菌株单菌落,用质量分数0.85%无菌NaCl溶液制成菌悬液,参照0.5麦氏标准比浊法计数并调整菌液浓度为1.5×108CFU·mL-1。用灭菌枪头吸取菌悬液100 μL均匀涂布于NA培养基,在无菌条件下,用无菌镊子分别将含药纸片紧贴于NA琼脂表面,每个平板贴3片,28 ℃培养24 h后观察结果并用游标卡尺测量抑菌圈直径。根据美国临床实验室标准协会(CLSI)的抗菌药物敏感性试验执行标准,判定并分析CQ1808菌株对抗菌药物的敏感特性[22]。

1.7 人工感染试验

试验前将健康宽体金线蛭用质量分数2.0%的NaCl溶液浸泡消毒10 min,然后放于水族缸中暂养观察1周,确认无异常后用于人工感染试验。驯养和试验期间每天正常投喂管理,用水为曝气24 h以上的自来水,pH值6.8～7.0,水温(24±0.5)℃,溶氧量(7.3±0.3)mg·L-1。

将-80 ℃保存的纯化菌株接入NB培养基中,200 r·min-1、28 ℃振荡培养18 h后,4 000×g离心15 min沉淀菌体,洗涤2次后重悬于质量分数0.85%的NaCl溶液中。采用0.5麦氏标准比浊法计数并将菌液浓度调整为1.5×108CFU·mL-1。将宽体金线蛭分成4个试验组和1个对照组,每组20条,试验组分别用不同浓度的菌悬液(即1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU·mL-1,分别命名为S5、S6、S7和S8)进行背部肌内注射感染,每条注射100 μL菌液,对照组注射等体积质量分数0.85%的NaCl溶液[23]。定期观察并记录各组水蛭的发病和死亡情况,连续观测7 d,取发病严重症状明显的宽体金线蛭及时进行病理解剖和病原菌的再次分离培养、鉴定。

1.8 组织病理学观察

分别取患水肿病症状明显的宽体金线蛭和对照组健康宽体金线蛭样本,无菌解剖,用体积分数10%的中性福尔马林溶液固定24 h,用体积分数70%的乙醇保存,依次经乙醇梯度脱水、TO透明剂透明、石蜡包埋,然后切成5 μm厚的切片,经HE染色和中性树胶封片后,置于数码光学显微镜下进行病理组织学观察、拍照,对病理学变化特征进行描述。

2 结果与分析

2.1 自然患病情况

经对患病宽体金线蛭体内外检查,未见寄生虫、真菌和病毒感染,其主要临床症状表现为:蛭体伸缩活力极为低下,身体明显肿胀,有的前、后吸盘和腹面局部充血明显(图1),剪开体腔可见大量棕褐色积液,嗉囊和嗉囊盲囊等消化系统器官充血明显。

A和B分别为健康宽体金线蛭的外观和体腔;C和D分别为外观水肿(*)、吸盘和腹部的局部红肿(箭头);E为外溢的棕褐色体腔液(箭头)和嗉囊充血(*)。A and B, Surface and body cavity of healthy Whitmania pigra; C and D, Appearance of edema (*), local hyperemia in the suction cup and ventral surface (black arrow); E, Overflowed brown body cavity fluid (arrow), congestion of in the crop (*).图1 患病宽体金线蛭的临床症状Fig.1 Clinical symptoms of diseased Whitmania pigra

2.2 分离菌形态特征和培养特性

取患病宽体金线蛭体腔液划线分离和纯化培养,得到1株细菌,命名为CQ1808。如图2所示,CQ1808菌株在NA平板上生长情况良好,形成淡白色、圆形、表面光滑、湿润和不透明的菌落(图2-A);CQ1808菌株为革兰氏阴性短杆状细菌,平均大小为(0.64～0.94)μm×(1.22～1.32)μm,单个或成对(图2-B)。

图2 CQ1808菌株的菌落形态与革兰氏染色结果Fig.2 Colony morphology and Gram staining result of CQ1808 strain

分离株的生理生化鉴定结果见表1。根据细菌鉴定手册可知,除蔗糖外,该菌株和弗氏柠檬酸杆菌参照菌株LMG 3246的生理生化鉴定结果基本一致。因此,CQ1808菌株被鉴定为柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的弗氏柠檬酸杆菌。

表1 CQ1808菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of CQ1808 strain

2.3 分子生物学鉴定

通过PCR扩增获得了CQ1808菌株的16S rDNA基因序列,其大小为1 287 bp(GenBank登录号MZ314016)。BLAST结果发现,该菌株的16S rDNA片段与柠檬酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌(NR117752.1)聚在一起,同源性为99%。从中选择同源性较高的柠檬酸杆菌属和其他属细菌的16S rDNA基因序列进行系统发育分析,CQ1808菌株与肠杆菌科的克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri, NR117751.1)的亲缘关系比其与弧菌科的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila, NR115183.1)和维氏气单胞菌(Aeromonasveronii, NR044845.1)的亲缘关系更近。系统发育树结果表明,CQ1808菌株为弗氏柠檬酸杆菌(图3)。

使用邻接法和Kimura 2参数模型。Bootstrap值表示1 000次检验置信度的百分比。Using the neighbor-joining method with the Kimura 2-parameter model. Bootstrap values expressed as a percentage of 1 000 replicates.图3 CQ1808菌株基于16S rDNA基因序列的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of CQ1808 strain based on 16S rDNA sequence

2.4 药敏试验

抗生素敏感性试验(表2)结果显示,CQ1808菌株对21种抗生素高度敏感,包括氨曲南、头孢曲松和头孢哌酮;对头孢他啶等7种抗生素中度敏感;对青霉素等9种抗生素表现耐药。目前,高敏药物中的氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星已用于宽体金线蛭养殖生产中水肿病等细菌性疾病的防治,收到了十分明显的效果。

表2 CQ1808菌株的37种抗生素药物敏感性Table 2 The antibiotics susceptibility of CQ1808 strain against 37 antimicrobial agents

2.5 人工回归感染结果

用1.0×105～1.0×108CFU·mL-1的菌悬液分别人工肌肉注射感染后,宽体金线蛭出现与自然发病相似症状,初期表现为焦躁不安、游动较频繁,随后游动变缓慢、活力减弱,部分个体体型弯曲、体表出现褶皱;感染严重的个体躯干出现局部僵硬、后腹部有充血现象或变红肿,甚至全身呈水肿状(图4)。S7和S8试验组第1天开始出现死亡,死亡宽体金线蛭体表黏液明显增多。最终,S5、S6、S7和S8试验组的宽体金线蛭在攻毒后7 d内累积死亡率分别为5%、30%、80%和100%(图5)。解剖刚死亡宽体金线蛭,在体腔中观察到明显的棕褐色积液,肠道、嗉囊、嗉囊盲囊有较明显充血现象。同时,从感染死亡宽体金线蛭体腔能再次分离到纯度高度一致的菌株,其菌落形态与菌体形态、大小、染色和生理生化特性等与从自然发病宽体金线蛭分离到的病原菌一致。由此证实,所分离的CQ1808菌株为宽体金线蛭水肿病的致病菌。

A,外观红肿;B,体腔液外溢、消化道和体腔壁充血。A, Appearance of edema; B, Spillage of fluid from the body cavity, congestion of the digestive tract and body cavity wall.图4 宽体金线蛭人工感染CQ1808菌株后的患病症状Fig.4 Symptoms of leeches infected with CQ1808 strain

2.6 组织病理学变化

健康宽体金线蛭嗉囊柱状上皮和肌层组织与体腔的纵肌组织中没有炎性细胞浸润(图6-A、6-B、6-C)。因致病菌感染,宽体金线蛭受损的器官主要为消化道,病蛭组织结构整体异常,嗉囊结构被破坏(图6-D)。病蛭表现为由单层柱状上皮和肌层所形成的褶皱结构紊乱,排列不齐,在嗉囊中可见外肌层坏死形成的碎屑和增生(图6-E)。此外,在病蛭体腔的纵肌周围可以观察到大量的短杆菌和嗜酸性粒细胞(图6-F)。

A-C和D-F分别为健康宽体金线蛭和患病宽体金线蛭的嗉囊、嗉囊内壁褶皱和体腔壁局部纵肌。D,消化系统整体结构异常,病理变化最显著的为嗉囊(箭头);E,嗉囊内壁单层柱状上皮和肌层形成的褶皱(*),且上皮细胞和外肌层坏死脱落形成碎片并出现增生(箭头);F,病蛭体腔壁局部纵肌周围可见大量短杆菌(白色箭头)和炎性细胞浸润(黑色箭头)。Figures A-C and D-F were the crop, inner crop wall folds and local longitudinal muscles in the body cavity wall of healthy and diseased leeches, respectively. D, Abnormal structure of the overall digestive system, the most distinct pathological changes in the crops (arrow); E, Folds in columnar epithelium and myometrium (*), fragments and proliferate in the crops (arrow); F, A large number of bacteria (white arrow) and inflammatory cell infiltration (black arrow) around localized longitudinal muscles in the body cavity wall of the diseased leeches.图6 宽体金线蛭感染CQ1808菌株前后的病理变化图谱Fig.6 Pathological changes in Whitmania pigra before and after infection with CQ1808 strain

3 讨论

3.1 CQ1808菌株的致病性

弗氏柠檬酸杆菌广泛分布于土壤、水体和食物中,从哺乳动物、鸟类、爬行类和两栖类动物体内均有分离到,能引起鱼、虾、鳖等多种水生动物感染发病[10,24-25]。该菌的流行严重影响水产养殖业的可持续发展,其潜在危险性不可忽视[26]。大量研究表明,鱼类感染弗氏柠檬酸杆菌发病的特征是排泄孔红肿、皮肤溃疡、皮下有出血点、腹部出血性瘀斑、间质出血等[10,14,26]。组织病理学观察发现,弗氏柠檬酸杆菌可导致小龙虾肝胰腺和肠道细胞空泡化、微绒毛坏死和细胞质裂解、肠道组织坏死、呼吸道上皮细胞从鳃膜上脱落[12]。弗氏柠檬酸杆菌还可导致中华鳖患败血症,主要表现为全身水肿、颈部溃烂和腹水充盈[27]。此外,苗珍等[28]研究表明,弗氏柠檬酸杆菌可以引起多家养殖场的中华绒螯蟹大批死亡,人工感染该菌后幼蟹表现出活力下降,行动迟缓,对外界刺激反应慢等症状。

宽体金线蛭在我国作为中药材应用的历史悠久,因其有效成分对人类心脑血管等疾病具有较明显的防治效果而受到广泛关注[3-5]。然而,目前国内外对水蛭疾病方面的研究相对较少,对其病害防治方面的探讨也不够深入。本研究从患有全身性水肿的病蛭体内分离得到CQ1808菌株,经人工感染导致宽体金线蛭发病,症状与自然发病相同,具体表现为腹部水肿、消化器官充血和棕褐色体腔液充溢等现象。在本研究中,患病宽体金线蛭的患病症状和病理变化与已报道的鱼类等水生动物相似[12,27-28]。总体上,作为一种条件致病菌,弗氏柠檬酸杆菌最有可能通过外伤入侵局部的皮肤或肌肉,随着病情加重逐渐向其他部位扩散,最终导致宽体金线蛭的全身水肿甚至死亡[9]。嗉囊和肠道是宽体金线蛭重要的食物消化和营养运输器官[29],本研究中患病宽体金线蛭的单层柱状上皮和肌层所形成的褶皱结构紊乱和外肌层坏死严重影响了嗉囊和肠道结构功能的完整性,这使病蛭的摄食能力和对外界环境应激的抵抗能力进一步降低,加速了宽体金线蛭的死亡。

从回归感染的患病宽体金线蛭分离的病原菌的生理生化特性和16S rDNA序列与分离株CQ1808一致,这表明CQ1808菌株是导致宽体金线蛭水肿病的病原菌,被鉴定为弗氏柠檬酸杆菌。此外,弗氏柠檬酸杆菌也是一种人畜共患病的病原体,人类的感染通常与接触受感染的水生动物有关。这警示相关学者需要密切关注该病原菌在水生动物中的流行病学传播途径,该病原菌的致病机制和防控方法也值得深入研究。

3.2 CQ1808菌株的耐药性

目前,临床分离的弗氏柠檬酸杆菌引起的水生疾病的传统防治仍依赖抗生素。本研究中,药物敏感性试验表明,弗氏柠檬酸杆菌对氨曲南、头孢曲松、头孢哌酮等21种药物高度敏感,对头孢他啶、头孢唑啉、卡那霉素等7种药物中度敏感。该结果为宽体金线蛭养殖生产中对该病的防治提供了科学依据。根据水产养殖用药明白纸2022年1、2号[30],本研究结果中的高敏药物氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、磺胺甲恶唑和中敏药物新霉素可在水蛭养殖生产中使用。然而,弗氏柠檬酸杆菌含有高度的多药耐药基因,长期使用抗生素会造成抗生素残留、生态风险和耐药性风险等环境安全问题[31-32]。本研究也证明,CQ1808菌株对青霉素、头孢呋辛、麦迪霉素等9种药物表现出耐药。并且,欧盟、美国等现在限制使用抗生素,因此,在养殖实践时应该采取进一步的策略,防治疾病时应正确用药,以更好地预防弗氏柠檬酸杆菌感染[33]。相比而言,中草药能有效提高水生动物的生长性能,有效预防和控制水生动物的病害,提高抵御细菌感染的存活率[34],作为免疫调节因子,多年来已被广泛应用于鱼、虾、蟹养殖中[35-36]。因此,未来可考虑通过中草药与某些特定抗生素联合用药的方式,以期达到协同抑菌的效果,从而降低致病菌的耐药性。

4 结论

本研究从我国养殖的重要中药资源宽体金线蛭中分离到弗氏柠檬酸杆菌,该菌株对养殖宽体金线蛭具有较高的致病性。本研究结果不仅提供了宽体金线蛭养殖性细菌病原的报告,还为未来水产养殖中弗氏柠檬酸杆菌感染的防治方法提供了理论基础。