李鸿儒，赵清辉*，王永辉，周静，陈庭瑞

（驻马店市中心医院a:药学部；b:创伤骨科，河南驻马店 463000）

骨质疏松症（osteoporosis,OP）好发于中老年人与绝经后女性，易引发脆性骨折，致残、死亡风险较大［1］。有报道中老年人群OP 患病率20%，且以肾虚血瘀证常见［2］。有指南指出，OP 发病率较高，发生骨折的风险大且80%左右为女性，特别是绝经后女性，建议对高风险女性加强筛查［3］。可见加强高风险人群OP 筛查，防治OP 相关骨折具有重要的临床、社会意义。目前治疗OP 及其相关骨折的方法较多，药物上有雌激素、钙剂等，部分用药效果不好或有严重不良反应［4］。近年来中医药在OP 骨折治疗中应用较多，中医上OP 属于“骨痿”“骨痹”等范畴，其发病与肾、肝、脾虚损、外邪侵袭等有关，且呈现渐进缓慢特点［5］。丹皮酚为牡丹、徐长卿提取物，具有散瘀止痛、抗菌消炎功效，还能抗氧化、抑炎、改善微循环，且可对p38 MAPK 等相关通路影响以抑制滑膜细胞损伤、炎性反应等［6］。有报道丹皮酚保护软骨细胞的机制可能与Wnt/β-catenin 信号通路抑制，降低基质金属蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases,MMP-9）等指标有关［7］。杨黎等［8］报道称丹皮酚可能通过抑制Toll 样受体-4（toll-like receptor,TLR4）/核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信号通路降低肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）的产生。MMP-9 与破骨吸收密切相关，参与OP 发病［9］；NF-κB 被认为是破骨细胞活性的关键调节因子，能介导炎症、免疫应答等，于OP 中高表达［10］。本研究通过分析丹皮酚对OP 骨折大鼠骨代谢及NF-κB/MMP9 信号通路的影响，为OP 骨折防治提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级SD 雌性大鼠52 只，体重250～300 g，平均（280.0±15.0）g，由河南省实验动物中心提供，许可证号为SYXK（豫）2017-0001，关于大鼠相关操作符合实验动物伦理要求。随机将其分为假手术组、模型组、骨化醇组与丹皮酚组，每组13 只。

1.2 模型建立

假手术组，仅打开腹腔，对卵巢附近脂肪组织切除。其他三组均腹腔打开，且将双侧卵巢切除，伤口缝合。常规饲养10 周后，通过双能X 线骨密度仪对各大鼠骨密度值（bone mineral density,BMD）进行测定，若建模大鼠BMD 值比假手术组大鼠BMD 平均值小2.5 个标准差，则提示建模成功。

随后将所有大鼠右侧股骨横向锯断，立即用克氏针固定骨折，伤口缝合。

1.3 药物干预

于骨折固定术后次日对大鼠进行药物干预，假手术组、模型组均给予用药同体积生理盐水灌胃，均1次/d，连续12 周。骨化醇组大鼠行阿法骨化醇（华润双鹤药业股份有限公司）0.05 μg/kg 灌胃，丹皮酚组给予200 mg/kg 丹皮酚（陕西博林生物技术有限公司）灌胃，均1 次/d，连续12 周。

1.4 检测指标

1.4.1 BMD 测量

于给药前和给药12 周后，采用双能X 线骨密度仪测定各组大鼠股骨BMD，模式为Hi-red small animal。

1.4.2 骨微CT 检测

于给药12 周处死动物后取各组大鼠股骨样本，于股骨远端干骺区域通过micro-CT 扫描仪测定各组大鼠骨小梁数量、厚度与分离度。分辨率18 mm、电流分别为385 μA。

1.4.3 血清检测

给药12 周后取血，采用酶联免疫分析（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）测定各组大鼠血清Ⅰ型前胶原羧基端前肽（type I procollagen propeptide,PINP）、骨钙素（bone gla protein,BGP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）水平。通过酶标仪在450 nm 处对吸光度值进行测定，依据标准曲线计算样本浓度。同时经由ELISA 测定各组大鼠血清TNF-α、白细胞介素（Interleukin）-6、IL-8 水平。相关试剂盒购自汉云克隆科技股份有限公司与上海酶联生物科技有限公司。

1.4.4 qRT-PCR 检测

TRIzol 法提取各组大鼠股骨骨髓组织总RNA，逆转录合成nDNA，PCR 扩增，严格按照相关说明书进行。NF-κB p65 上下游引物分别为5’-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3’、5’-TTTCTTCAATCCGGTGGCGA-3’；MMP-9 上下游引物分别为5’-GCCGACTTATGTGGTCTTCC-3’、5’-GCTTCTCTCCCAT CATCTGG-3’，以GAPDH 为内参，其上下游引物分别为5’-GAAGCTGGTCATCAACGGGA-3’、5’-G GCGGAGATGATGACCCTTT-3’。相关参数：50℃120 s，95℃10 min，95。经由2-△△CT 法计算NFκB p65、MMP9 mRNA 相对表达量。

1.4.5 Western Blot 检测

裂解液提前室温解冻，适量骨髓组织放入研钵中，裂解液滴入后冰上静置，上清液提取后通过BCA 蛋白试剂盒检测蛋白浓度。制备好电泳装置与聚丙烯酰胺凝胶，电泳操作：80 V 电泳150 min。300 mA 让蛋白转移到PVDF 膜上。TBST 缓冲液内滴入脱脂牛奶制备封闭液，膜入封闭液，室内常温封闭120 min，之后分别加入磷酸化（p）-NF-κB p65、MMP9 一抗（体积比均为1∶1 000 稀释），4℃孵育过夜。次日TBST 缓冲液洗膜4 次，5 min/次，加入1∶5 000 稀释的二抗，室温孵育1 h。洗膜后滴入ECL试剂，让其显色，凝胶成像系统成像分析。β-actin为内参，Image J 软件对相关蛋白显影图进行分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 BMD 与骨微CT 定量检测

四组大鼠BMD 与骨微CT 定量检测结果见表1。给药12 周后BMD 由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。骨小梁数由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05），骨小梁厚度由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05）；而骨小梁分离由低至依次为：假手术组＜丹皮酚组＜骨化醇组＜模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。

表1 四组大鼠BMD 与骨微CT 定量检测比较（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

表1 四组大鼠BMD 与骨微CT 定量检测比较（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

指标BMD(g/cm2)骨小梁数(mm-1)骨小梁厚度(μm)骨小梁分离度(mm)假手术组（n=13）0.31±0.06 5.5±0.6 78.5±5.4 0.23±0.04模型组（n=13）0.19±0.04 3.0±0.4 46.9±3.8 0.37±0.07骨化醇组（n=13）0.25±0.05 4.5±0.5 70.8±5.0 0.26±0.05丹皮酚组（n=13）0.26±0.06 4.7±0.6 72.3±4.7 0.25±0.06 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血清检测

给药12 周后血清检测结果见表2。PINP 由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05）；血清BGP 由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05）；血清ALP 由高至低依次为：假手术组＞丹皮酚组＞骨化醇组＞模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。而血清TNF-α、IL-6 和IL-8 由低至高依次均为：假手术组＜丹皮酚组＜骨化醇组＜模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。

表2 四组大鼠血清指标检测比较（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

表2 四组大鼠血清指标检测比较（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

指标PINP(μg/L)BGP(μg/L)ALP(U/L)TRAP(μg/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)假手术组（n=13）93.6±13.0 2.1±0.2 201.0±23.6 1.5±0.4 4.0±1.3 1.7±0.4 2.9±0.7模型组（n=13）26.5±6.2 0.9±0.2 112.4±12.7 2.8±0.6 20.4±4.6 3.5±0.8 12.3±2.4骨化醇组（n=13）80.7±10.5 1.6±0.3 175.2±15.4 2.0±0.5 8.6±2.3 2.2±0.6 5.0±1.3丹皮酚组（n=13）82.4±11.3 1.7±0.4 180.3±18.6 1.8±0.4 8.0±2.9 2.0±0.5 4.7±1.2 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 标志物mRNA 和蛋白表达检测

给药12 周后骨标志物mRAN 和蛋白检测结果见表3。NF-κB p65 和MMP 的mRNA 表达均由低至高低依次为：手术组＜丹皮酚组＜骨化醇组＜模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。p-NF-κB p65 和MMP9 蛋白表达由低至高依次为：假手术组＜丹皮酚组＜骨化醇组＜模型组，差异有统计意义（P＜0.05）。

表3 四组标志物mRNA 和蛋白表达检测（相对表达量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

表3 四组标志物mRNA 和蛋白表达检测（相对表达量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

指标qRT-PCR NF-kB-p65 MMP9 Western Blot P-NF-kB-p65 MMP9假手术组（n=13）模型组（n=13）骨化醇组（n=13）丹皮酚组（n=13）P 值3.0±0.4 1.0±0.3 4.2±0.3 2.0±0.5 3.5±0.7 1.4±0.4 3.3±0.5 1.3±0.3＜0.001＜0.001 0.15±0.03 0.4±0.1 0.50±0.10 1.8±0.3 0.22±0.06 0.7±0.3 0.20±0.04 0.6±0.2＜0.001＜0.001

3 讨论

据统计，我国＞50 岁居民OP 发生率19.2%，女性OP 比例32.1%，是男性的5 倍左右［11］。故选择雌性大鼠进行本次实验，通过切除卵巢构建OP，且横向锯断股骨以形成骨折，相比假手术组，模型组及其他组给药前BMD 值均显著降低，提示OP 骨折大鼠建模成功。相比模型组，骨化醇组、丹皮酚组给药12 周后BMD 值均显著高，且骨小梁数目明显增多，骨小梁形态明显改善。提示西药（阿法骨化醇）与丹皮酚均能提高OP 骨折大鼠骨密度，恢复骨小梁异常形态，与张富财等［12］报道基本相符。骨代谢指标与OP 及其相关骨折密切相关［13］。其中PINP可直接反映I 型胶原合成速率［14］；ALP 参与成骨过程，通过对磷酸酯、焦磷酸盐活性水解可促骨形成［15］；BGP 多源于成骨细胞，其水平高低关系到成骨细胞活性［16］；TRAP 则与破骨细胞有关，其水平高低反映破骨细胞活性［17］。本实验骨化醇组、丹皮酚组给药后血清PINP、BGP、ALP 水平比模型组均显著增高，TRAP 水平显著降低。提示阿法骨化醇与丹皮酚均能抑制破骨细胞活性，促进骨细胞形成。这可能与丹皮酚具有促进骨折愈合、抗骨关节炎等药理作用有关。

OP 骨折属于慢性炎症疾病，IL、TNF-α 等炎性因子参与OP 骨折发生、进展［18］。MMP-9 被发现在OP 发病中发挥重要作用，其抑制MMP-9 基因及蛋白表达是促破骨细胞凋亡的可能机制［19］，并通过对软骨组织（非矿化）降解，释放血管内皮生长因子直接活化破骨细胞。NF-κB 参与炎症过程，通过对NF-κB 信号通路及其相关炎症指标抑制可促成骨细胞生长，在OP 防治中发挥作用［20］。有报道称，NFκB 的结合位点在MMP-9 启动子内，MMP-9 表达受NF-κB 影响［21］。Sabry M 等［22］研究表明，MMP-9、NF-κB 高表达与绝经后骨质疏松发生有关。Liu等［23］研究表明丹皮酚可通过抑制IL-1β 等诱导的软骨细胞炎症以控制骨关节炎病情。本实验中，相比假手术组，模型组血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均显著增高。提示血清炎症指标参与OP 骨折发病过程。且骨化醇组、丹皮酚组治疗后血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均比模型组显著降低。提示丹皮酚能有效抑制血清促炎因子，这可能与丹皮酚抗菌消炎、抗氧化、抑炎作用有关。另外，周晓慧等［24］研究表明丹皮酚通过对NF-κB/MMP-9 信号通路下调可逆转心肌梗死后心室重构。有研究表明，丹皮酚可能通过调控Wnt/β-catenin、TLR4/MYD88/NF-κB 信号通路发挥软骨细胞保护、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用［7，25］。本实验中，丹皮酚组治疗后股骨骨髓组织中NF-κB p65、MMP mRNA 表达与p-NF-κB p65、MMP9 蛋白水平比模型组均显著降低。提示丹皮酚能有效调控OP 骨折大鼠NF-κB/MMP-9 信号通路，抑制炎症以促进骨愈合。

综上所述，丹皮酚可能通过下调NF-κB/MMP-9信号通路，抑制IL-6、IL-8 等炎性因子，以恢复破骨、成骨细胞平衡，达到治疗OP 骨折的目的，可为临床OP 骨折患者治疗提供新参考。但由于骨形成相关信号通路比较多，丹皮酚是否也影响其他信号通路尚需进一步研究。