李宗迪, 王亚琴, 吴建祥, 周雪平,2*

(1. 浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058；2. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

叶绿体是植物光合细胞的重要细胞器,不仅能进行光合作用为植物的生长发育提供能量,也在植物的免疫系统中扮演着核心角色[1-2]。叶绿体是植物细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成、抗病激素水杨酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmine acid, JA)生物合成以及钙离子储存的重要场所[3]。作为植物细胞内免疫信号的核心枢纽,叶绿体还能够通过逆行信号(retrograde signal, RS)来平衡植物激素间的串扰和实现细胞器间的信号交流,从而改变各种蛋白质的表达,调控光合作用和叶绿体免疫反应[4-7]。近年来,叶绿体免疫与植物病毒之间的相互作用受到越来越多的关注。本文将从叶绿体免疫反应抵抗植物病毒侵染以及植物病毒干扰叶绿体免疫反应这两个方面进行综述,并展望叶绿体免疫与植物病毒互作领域的未来研究方向。

1 叶绿体免疫反应抵抗植物病毒侵染

1.1 叶绿体活性氧介导对植物病毒的抗性

在植物病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)触发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)过程中,位于细胞膜表面的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别相应的PAMP后会磷酸化蛋白激酶BAK1(brassinosteroid-insensitive 1-associated receptor kinase 1),磷酸化的BAK1再经过一系列的磷酸化反应激活细胞膜上的RBOHD(respiratory burst oxidase homolog protein D, RBOHD),促使质外体ROS的快速生成[8]。在植物细胞内,线粒体、叶绿体及过氧化物酶体都能产生ROS,但是Wrzaczek等发现在具有光合能力的组织中,叶绿体是植物细胞内ROS生成的最主要场所[9]。叶绿体活性氧(chloroplast ROS, cROS)的生成依赖于在类囊体膜上进行的光合电子传递。在类囊体膜上进行的光反应除了将植物吸收的光能转化为能量ATP和NADPH,并将水分解生成氧分子(O2)和质子(H+)之外,还会生成诸如超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)等活性氧物质[10]。其中,光系统Ⅱ、细胞色素b6/f复合物、光系统Ⅰ是生成cROS的主要场所[10-11]。据报道,植物病毒的侵染能够诱导cROS的迸发[12-14],病毒诱导生成的cROS除了可以诱发过敏性坏死反应(hypersensitive reaction, HR)限制病毒的侵染之外,还可以作为重要的信号分子将免疫信号逆向传递至细胞核,激活更强烈的免疫反应[15-16]。

Rosa Lozano-Duran团队发现在番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)、甜菜曲顶病毒(beet curly top virus, BCTV)及茼麻花叶病毒(abutilon mosaic virus, AbMV)侵染的细胞中,会发生叶绿体向细胞核周围聚集的现象[17]。进一步研究发现,ROS是核周围叶绿体聚集的诱导剂,暗示着cROS可以作为信号分子促进叶绿体和细胞核间的交流,从而抵抗病毒的入侵[17]。此外,Caplan等发现在烟草中,具有核苷酸结合位点且富含亮氨酸重复序列的免疫受体(nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors, NLRs)N能够识别烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)复制酶p50的解旋酶结构域,诱导HR反应和植物对TMV的抗性[18]。叶绿体蛋白NRIP1(Nreceptor-interacting protein 1)与N免疫受体和p50间均存在直接的相互作用,并且N识别p50所介导的抗性需要NRIP1的参与[18]。在同时表达N和p50或者TMV感染的烟草细胞中,会出现NRIP1从叶绿体转运至细胞核的现象,并且还可以观察到叶绿体基质向外凸起形成基质小管(stroma-filled tubule, stromule)结构[18]。进一步的研究发现p50诱导的叶绿体stromule可以直达细胞核,并且可以观察到NRIP1通过stromule从叶绿体向细胞核转运的现象[16]。值得注意的是,对细胞内H2O2水平进行实时观察的结果显示,在叶绿体中生成的cROS可以通过stromule转运至细胞核,而细胞核中的ROS积累可以激活下游更为强烈的免疫反应[16]。这些研究结果表明,cROS是叶绿体生成的重要免疫信号分子,并且可以通过stromule从叶绿体向细胞核的转运,激发植物对病毒的抗性。

1.2 叶绿体合成的相关激素介导对植物病毒的抗性

植物激素在植物生长发育,响应生物及非生物胁迫过程中都起着关键作用,同时也参与了植株对植物病毒的防卫反应[19-21]。其中,水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)作为重要的抗病激素,两者的生物合成与叶绿体密切相关[22-23]。

在叶绿体中,SA的合成主要通过异分支酸合酶途径进行,SA的前体分支酸(chorismic acid, CA)在异分支酸合酶1(isochorismate synthase 1, ICS1)的催化下生成异分支酸(isochorismate, ISC),ISC再在氨基转移酶PBS3的催化下直接生成SA[24]。叶绿体合成的SA通过EDS5(enhanced disease susceptibility 5)转运至细胞质中,破坏细胞质中以低聚体形式存在的NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)蛋白的二硫键,使其成为单体。NPR1单体则会进入细胞核中激活病程相关(pathogenesis related, PR)蛋白的表达[25]。SA不仅可以诱导局部过敏性坏死反应,且与系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)密切相关[26]。Campos等证实SA处理后的番茄表现出对番茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)更强的抗性,在接种病毒后发病时间延迟且病毒积累量显著降低[27]。2014年,万建民团队克隆了第一个水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)的抗性基因STV11[28]。STV11编码一个磺基转移酶,能够将SA催化为磺化SA,磺化SA可以显著增强水稻对RSV的抗性[28]。研究表明SA还通过干扰病毒的细胞间移动、长距离运输和复制等过程以实现对病毒的防御[19-20, 29]。例如,Tian等发现番茄丛矮病毒(tomato bushy stunt virus, TBSV)的复制依赖于与三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的相互作用,而SA可以通过竞争结合GAPDH来抑制TBSV的复制[30]。

JA是一种脂质衍生的激素,它的生物合成主要通过十八烷途径进行,该过程大部分阶段发生在叶绿体中,合成的最后阶段需要在过氧化物酶体中进行,而修饰JA的酶则在细胞质内[31]。JA合成途径的底物是α-亚麻酸(α-linolenic acid,α-LeA),α-LeA在脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)的催化下生成13-氢过氧亚麻酸(13-hydroperoxy derivative 13(S)-hydroperoxy-octadecatrienoic acid, 13-HPOT),13-HPOT在丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase, AOS)和丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase, AOC)两步催化下生成12-氧-植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid, OPDA)。OPDA在过氧化物酶体中经过进一步还原和三步β氧化反应即可形成JA[32]。

研究发现外源施加JA可以诱导植物对包括番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)、TMV以及RSV在内的多种植物病毒的抗性[33-35]。此外,RSV编码的外壳蛋白(coat protein, CP)能够诱导细胞内JA的显著积累,从而上调表达JA通路上的关键转录因子MYB(MYB transcription factor gene),并诱导RNA沉默通路上核心蛋白Argonaute 18(AGO18)的表达[36-37]。AGO18一方面能够促进AGO1与病毒的干扰RNA(siRNA)结合,另一方面还能与AGO1竞争结合miR528,调控细胞内的氧化还原稳态,促进ROS的积累来增强水稻对RSV的抗性[36-37]。

1.3 钙离子信号通路促进叶绿体免疫

叶绿体是植物细胞内钙离子储存的重要场所。钙离子除了参与植物的生长发育过程之外,在植物响应多种生物和非生物胁迫过程中也发挥着重要的作用。病原物的侵染往往会导致植物体内的钙离子水平发生变化,这种变化导致的钙离子流动反应可以作为防御信号激活寄主体内的免疫反应。用铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa鞭毛蛋白N末端的22 aa短肽(flg22)、几丁质(chitin)、隐地蛋白(cryptogein)和寡半乳糖醛酸(oligogalacturonic acid)诱发植物产生PTI反应后,可以在叶绿体基质中检测到轻微但持久的钙离子浓度升高[38]。Nomura等发现PTI引起的钙离子信号的迸发会被定位于叶绿体的钙敏感受体(calcium sensing receptor, CAS)感知。CAS是一种低亲和力、丰度较高的钙离子结合蛋白,位于类囊体膜上,是叶绿体免疫反应的关键蛋白,其在结合钙离子后被磷酸化并调控叶绿体基质中的钙离子浓度迅速增加。叶绿体中的钙离子信号能够激活SA的合成及细胞核内抗病相关基因的表达,从而抵抗各种病原物的侵染[38]。Medina-Puche等发现植物中钙依赖蛋白激酶16(calcium-dependent protein kinase 16, CPK16)的N端同时具有豆蔻酰化位点和叶绿体转运信号肽(chloroplast transit-peptide, cTP),其在PTI反应被激活的情况下,会发生从质膜向叶绿体的重新定位。CPK16在叶绿体中的积累能够增强钙离子信号传递、PR蛋白表达等一系列PTI反应。进一步研究发现在拟南芥中过表达叶绿体定位的CPK16能够显著促进拟南芥对TYLCV的抗性[39]。这项研究表明叶绿体介导的钙离子信号可以直接参与植物的抗病毒反应。

1.4 光合作用相关蛋白参与对病毒的抗性

研究表明光合作用中的许多组分在抵抗病毒侵染方面有着关键的作用。例如,对核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(rubulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit, RbcS)下调表达的烟草接种番茄花叶病毒(ToMV)和TMV后,感病症状加重,病毒积累量增加,并且病程相关基因PR1的表达受到了显著的抑制[40]。此外,在RbcS被沉默的植株中抗性基因Tm-22介导的烟草和番茄对ToMV及TMV的抗性出现了显著的减弱,表明RbcS在Tm-22介导的抗病毒过程中起到关键作用[40]。研究表明放氧复合体外周蛋白的两个亚基PsbO和PsbP均参与了寄主抵抗病毒侵染的过程[41-42]。Abbink等发现利用TRV-VIGS沉默PsbO可以显著促进TMV、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)及马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)对烟草的侵染[41],而Balasubramaniam等证实过表达PsbP能够显著抑制AMV的复制[42]。马铃薯Y病毒属病毒复制的过程中需要形成包涵体(cylindrical inclusion, CI)。光系统Ⅰ中的PSⅠ-K蛋白能够与李痘病毒(plum pox virus, PPV)形成的CI互作。PSⅠ-K由psaK基因编码,本氏烟中的psaK下调表达能够促进PPV的复制,表明PSⅠ-K具有显著的抗病毒功能[43]。

2 植物病毒抑制叶绿体介导的免疫反应

2.1 病毒下调叶绿体免疫相关因子的表达

植物病毒的侵染通常会伴随着褪绿、花叶等症状,暗示着病毒的侵染会导致光合作用相关蛋白(chloroplast photosynthesis-related proteins, CPRPs)出现不同程度的下调表达,而研究表明,大量CPRPs与叶绿体免疫密切相关。例如TMV的侵染导致光系统Ⅱ核心复合体中PsbA、LhcB1、LhcB2及放氧复合体PsbO显著下调表达,抑制光系统的活性,从而促进病毒症状的形成[44]。此外,CMV和ToMV侵染也会下调烟草叶绿体中免疫相关因子的表达,如光系统Ⅱ中的PsbO、PsbP、PsbQ及光系统Ⅰ中psaK、psaH等基因的表达[45-46]。RSV侵染亦会导致水稻和本氏烟中CPRPs的表达水平显著降低,从而抑制寄主的光合效率[47]。叶绿体中光合电子传递链的铁氧还原蛋白Ⅰ(ferredoxin 1, Fd1)被证实能够通过调控胞间连丝胼胝质的积累抵御PVX的侵染,而本氏烟被PVX侵染后NbFd1的表达被显著抑制[48]。最新的研究表明,Fd1同样可以负调控RSV的侵染,但由RSV RNA1二级结构产生的vsiR45349小干扰RNA能够靶向并降解Fd1的mRNA,促使Fd1下调表达,从而促进病毒侵染。另一方面RSV侵染诱导植株中脱落酸(abscisic acid, ABA)大量积累,促进脱落酸通路上的转录因子ABI5(ABA insensitive 5)表达,ABI5能够与Fd1基因启动子上的ABA响应元件ABRE结合以负调控其表达,进一步促进病毒的侵染[49]。

2.2 病毒干扰叶绿体免疫相关蛋白的转运

研究发现一些植物病毒编码的蛋白能够和叶绿体免疫相关蛋白互作并阻碍其进入叶绿体从而抑制叶绿体介导的免疫反应。例如,AMV的CP蛋白能够与放氧复合体亚基PsbP互作,并阻碍其进入叶绿体,而不能形成二聚体的AMV CP突变体丧失了与PsbP互作的能力。鉴于过表达PsbP显著增强了寄主对AMV的抗性,表明AMV CP很有可能通过劫持PsbP的方式抑制其介导的抗病毒反应[42]。类似地,过表达PsbP也能够增强水稻和本氏烟对RSV的抗性,而RSV编码的病害特异蛋白(disease specific protein, SP)可以通过和PsbP互作的方式限制其向叶绿体转运,从而导致寄主叶绿体的结构发生紊乱及光合作用受到抑制,促进RSV的侵染[50]。此外,大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)编码的P1蛋白和甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)编码的HC-Pro蛋白能够分别和细胞色素b6/f复合体还原型铁硫蛋白(cytochrome b6/f complex Rieske Fe/S)及铁氧还蛋白5(ferredoxin 5, Fd5)互作。Rieske Fe/S蛋白和Fd5蛋白都是核编码的叶绿体蛋白,且均与光合电子传递相关,而SMV P1与Rieske Fe/S间以及SCMV与Fd5间的互作均会抑制后者向叶绿体中转运,从而抑制光合电子传递介导的免疫反应,促进病毒症状的发生[51-52]。

2.3 病毒抑制叶绿体向核聚集

叶绿体向细胞核周围聚集的现象是植物响应生物胁迫的重要免疫应答[17]。研究发现叶绿体NADH脱氢酶复合体M亚基(NADH dehydrogenase-like complex M subunit, NdhM)可以诱导叶绿体在核周围的聚集并显著促进PR蛋白的表达以增强对芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus, TuMV)的抗性,而TuMV编码的VPg蛋白能够和NdhM在细胞核和核仁中发生相互作用,阻碍NdhM进入叶绿体,抑制NdhM所介导的核周叶绿体聚集[53]。进一步研究发现本氏烟的NdhM除了能够和TuMV编码的VPg蛋白互作之外,还可以和PPV编码的VPg蛋白及RSV编码的P2蛋白发生互作。此外,TuMV编码的VPg蛋白还可以和拟南芥及番茄的NdhM互作。这表明NdhM可能是病毒抑制叶绿体免疫的一个普遍靶标[53]。类似地,辣椒叶绿体外膜蛋白OMP24也被发现能够诱导叶绿体向细胞核聚集、stromule的形成及cROS的积累,从而促进叶绿体向细胞核逆行信号的传递。过表达OMP24能够增强辣椒对辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus, PMMoV)的抗性,并且OMP24介导的抗病毒能力依赖于其在叶绿体外膜的定位和其自身的相互作用[54]。然而,PMMoV编码的CP蛋白能够通过与OMP24直接互作的方式干扰OMP24自身互作,从而抑制其介导的免疫反应[54]。

2.4 病毒干扰免疫相关分子的合成

Reinero等在1986年报道了TMV的外壳蛋白能够进入烟草的叶绿体,这是关于病毒蛋白靶向叶绿体的首次报道[55-56]。近年来,一些研究发现植物病毒蛋白可以通过直接进入叶绿体的方式干扰免疫相关分子的合成以增强自身的毒性。例如,RSV编码的NSvc4蛋白能够在其N端1-20位氨基酸的引导下直接进入本氏烟的叶绿体,定位叶绿体的NSvc4蛋白的表达能够显著抑制cROS的合成和PR基因的表达[57]。进一步研究表明,NSvc4和叶绿体中的NbGAPDH-A及NbPsbQ互作,利用TRV-VIGS下调表达NbGAPDH-A和NbPsbQ能显著促进RSV对本氏烟的侵染,暗示着这两个基因很有可能参与了寄主对RSV的抗性[57]。

Rosa Lozano-Duran团队报道了CPK16蛋白从质膜向叶绿体的转运能够增强寄主对包括病毒在内的多种病原物的抗性,TYLCV编码的C4蛋白与CPK16类似,其N端同样具有豆蔻酰化位点和cTP,在病毒侵染时会发生从质膜向叶绿体转运的现象,定位于叶绿体的TYLCV的C4蛋白通过和CAS互作干扰钙离子信号的传递进而抑制SA的合成[39]。有意思的是,一些其他双生病毒编码的蛋白和细菌的效应子也具有质膜和叶绿体的双重定位信号。例如,BCTV编码的C4蛋白和青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum分泌的GALA1效应蛋白在寄主免疫反应被激活的情况下,均会从质膜转运至叶绿体中,并能够抑制胼胝质的积累、PR基因和SA通路上关键基因的表达[39]。这项研究不仅揭示了植物中存在一条连接质膜和叶绿体的重要免疫信号途径,还暗示了不同类别的病原物进化出了相似的策略来对抗该途径以削弱植物免疫反应,从而促进自身侵染。

此外,Ji等发现由核基因编码的JA合成通路上的关键蛋白AOC在细胞质中被翻译之后,需要在叶绿体信号识别颗粒54(chloroplast signal recognition particle 54, cpSRP54)的帮助下转运至类囊体中相应的位点发挥其功能。而TuMV编码的P1蛋白可以和cpSRP54发生互作并将其降解,从而干扰JA的合成,促进病毒的侵染[58]。PVX编码的p25蛋白以及辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)编码的126 kD蛋白也可以和cpSRP54互作并将其降解,暗示cpSRP54很有可能是多种病毒用以抑制JA信号通路的普遍靶标[58]。

3 展望

近年来,大量新的研究证实叶绿体在植物与病毒的军备竞赛中扮演着至关重要的角色。叶绿体一方面作为细胞内免疫信号网络的核心枢纽增强植物的抗病毒能力,另一方面也成为病毒攻击的关键靶点。叶绿体免疫是一个新兴研究领域,今后关于植物病毒与叶绿体免疫相互作用的研究应聚焦于进一步挖掘具有抗病毒功能的寄主叶绿体因子、解析叶绿体逆行信号在植物抗病毒反应中的关键作用以及病毒如何与叶绿体互作来抑制寄主的抗性。此外,还有一些基础的问题亟待解决,例如:植物病毒侵染诱导的cROS是如何产生的?cROS在免疫反应过程中的时空动态变化如何?叶绿体在细胞核周围聚集的意义?叶绿体与其他细胞器间存在怎样的逆行信号?是否存在抑制病毒蛋白靶向叶绿体的寄主因子,从而减弱病毒的致病性?但目前的研究手段尚不能解决上述的问题,例如对免疫信号的时空动态观察,这就需要发展新的方法和工具。此外,目前常规的病毒蛋白与叶绿体互作研究的技术路线多是采用酵母双杂交文库筛选和质谱分析等方法,通过这类方法筛选得到的寄主因子还需进行叶绿体定位分析方能确定其是否为叶绿体相关的寄主因子。今后的研究可以考虑构建叶绿体相关基因的cDNA文库或是提取叶绿体蛋白直接进行质谱分析,从而提高筛选的效率和准确性。此外,新的蛋白质互作研究方法也值得应用,例如基于TurboID的邻近标记技术,该技术能够检测细胞内瞬时发生或微弱的蛋白质互作[59]。相信随着新的研究工具的研发,上述问题都能找到答案,这不仅有助于对叶绿体生物学的基本理解,而且将对开发具有广谱抗性的新作物具有重要意义。