成玉洁，刘贞汝，谭志同，沈亚龙，王守信，盛 筱

(济宁医学院 药学院，山东 日照 276826)

酪氨酸酶(tyrosinase，Tyr，EC 1.14.18.1)又称为多酚氧化酶，是一种含有多亚基结构的含铜金属氧化酶，主要存在于动物、植物、微生物和人体中，具有重要的生理功能[1]。在哺乳动物中，Tyr是参与黑色素生物合成的关键酶，Tyr的过度表达会导致雀斑、褐斑等色素沉着性疾病的发生，严重者可能会导致恶性黑色素瘤[2]。而当Tyr的活性降低，又会造成黑色素的缺失，引起白癜风、白化病等疾病[3]。此外，Tyr还与昆虫的蜕皮、伤口愈合以及水果蔬菜的酶促褐变直接相关[4-5]。因此，开发高效、低毒的 Tyr抑制剂和激活剂在化妆品、医药、农业等领域备受关注，已成为当今研究的热点。

研究发现，细胞在正常代谢过程中会产生自由基[6]，而当自由基浓度过高时会攻击生物体内的生物大分子，损害机体的组织和细胞，加快人体衰老，并会诱发心血管疾病、冠心病及癌症等[7]。抗氧化剂可以清除掉人体内多余的自由基，从而起到预防衰老和疾病发生的作用。所以，设计合成高活性的抗氧化剂一直是医药、食品、保健等领域的热门课题。

酚类化合物往往具有较好的Tyr抑制活性和抗氧化活性，其在Tyr抑制剂和抗氧化剂的研发中一直备受关注[8]。此外，酰腙类化合物因具有多样的药理活性，在药物研发中占有重要地位。研究发现，相比普通的Schiff碱，酰腙类Schiff碱具有稳定性更高、生物活性更好、化学毒性更低、更容易被生物降解等优点[9]。基于此，本研究拟将两个苯酚结构通过酰腙活性片段进行拼接，设计合成一系列含酚结构的酰腙类化合物，并初步测试它们对Tyr的抑制活性及抗氧化活性，为开发更多类型的酚类Tyr抑制剂与抗氧化剂提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

DNM-9602G酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；Bruker Avance NEO 400 MHz核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、各种羟基取代苯甲醛(分析纯，上海萨恩化学技术有限公司)；各种羟基取代苯甲酸甲酯、抗坏血酸、曲酸(分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司)；水合肼、L-多巴、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙盐酸盐水合物(MBTH)、过硫酸钾(分析纯，天津希恩思生化科技有限公司)；酪氨酸酶(合肥巴斯夫生物科技有限公司)，其余试剂均为市售分析纯。

1.2 合成路线

本文共合成16种含酚酰腙类化合物，合成步骤如图1所示。

图1 化合物D1-D16的合成路线

1.2.1 中间体B1～B4的合成

取 100 mL 圆底烧瓶，将 3 mmoL 取代苯甲酸甲酯(A1-A4)和 0.5 mL 80%水合肼溶于 10 mL 甲醇中，在 80 ℃ 下加热回流，TLC监测反应完全后，室温下静置或放冰箱中冷冻，析出大量固体。抽滤后用冷的甲醇洗涤，室温干燥后得到纯的中间体羟基取代苯甲酰肼B1-B4。

1.2.2 目标化合物D1-D16的合成

将 0.89 mmol 羟基取代苯甲酰肼(B1-B4)、1.30 mmol 羟基取代苯甲醛(C1-C4)、10 mL 甲醇置于 100 mL 圆底烧瓶中，滴加两滴醋酸，于 80 ℃ 的油浴中加热回流，TLC监测反应完全。冷却后将反应液置于冰箱中冷冻过夜，然后抽滤，用冷的甲醇洗涤，室温干燥后得纯的目标化合物。如若反应液冷冻后无固体析出或析出固体较少，可旋干反应液后，将粗产物用甲醇/水重结晶，则得到纯的目标化合物。

4-羟基-N′-(4-羟基苯亚甲基)苯甲酰肼(D1)，浅黄色固体，收率88%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.47(s，1H)，10.12(s，1H)，9.92(s，1H)，8.33(s，1H)，7.80(d，2H，J=8.0 Hz)，7.54(d，2H，J=8.0 Hz)，6.82～6.87(m，4H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.58，160.56，159.27，147.26，129.57，128.72，125.51，124.08，115.71，114.99。

N′-(2，4-二羟基苯亚甲基)-4-羟基苯甲酰肼(D2)，黄色固体，收率63%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.73(s，1H)，11.61(s，1H)，10.14(s，1H)，9.93(s，1H)，8.47(s，1H)，7.81(d，2H，J=8.4 Hz)，7.27(d，1H，J=8.4 Hz)，6.87(d，2H，J=8.5 Hz)，6.32～6.37(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.31，160.87，160.64，159.59，148.63，131.49，129.71，123.53，115.21，110.73，107.72，102.81。

N′-(3，4-二羟基苯亚甲基)-4-羟基苯甲酰肼(D3)，褐色固体，收率80%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.40(s，1H)，10.08(s，1H)，9.34(s，1H)，9.26(s，1H)，8.24(s，1H)，7.79(d，2H，J=8.7 Hz)，7.24(s，1H)，6.91(d，1H，J=7.7 Hz)，6.85(d，2H，J=8.6 Hz)，6.78(d，1H，J=8.1 Hz)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.62，160.62，147.89，147.54，145.82，129.65，126.10，124.26，120.51，115.68，115.09，112.74。

N′-(3，5-二羟基苯亚甲基)-4-羟基苯甲酰肼(D4)，褐色固体，收率92%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.55(s，1H)，10.16(s，1H)，9.47(s，2H)，8.23(s，1H)，7.80(d，2H，J=12.0 Hz)，6.86(d，2H，J=8.0 Hz)，6.59(s，2H)，6.26(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.72，160.70，158.71，147.27，136.22，129.68，123.91，115.06，105.12，104.34。

2，4-二羟基-N′-(4-羟基苯亚甲基)苯甲酰肼(D5)，黄色固体，收率93%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.49(s，1H)，11.56(s，1H)，10.24(s，1H)，9.98(s，1H)，8.34(s，1H)，7.81(d，1H，J=12.0 Hz)，7.56(d，2H，J=8.0 Hz)，6.84(d，2H，J=8.0 Hz)，6.36(d，1H，J=8.0 Hz)，6.32(d，1H，J=4.0 Hz)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.36，162.61，162.37，159.55，148.47，129.52，128.99，125.19，115.77，107.37，106.17，102.89。

N′-(2，4-二羟基苯亚甲基)-2，4-二羟基苯甲酰肼(D6)，浅黄色固体，收率76%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.34(s，1H)，11.78(s，1H)，11.42(s，1H)，10.26(s，1H)，10.00(s，1H)，8.53(s，1H)，7.80(d，1H，J=12.0 Hz)，7.31(d，1H，J=8.0 Hz)，6.35～6.39(m，2H)，6.33(s，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：164.95，162.77，162.31，160.83，159.52，149.33，131.35，129.55，110.54，107.77，107.51，105.86，102.89，102.69。

N′-(3，4-二羟基苯亚甲基)-2，4-二羟基苯甲酰肼(D7)，白色固体，收率92%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.50(s，1H)，11.49(s，1H)，10.22(s，1H)，9.43(s，1H)，9.31(s，1H)，8.25(s，1H)，7.79(d，1H，J=8.6 Hz)，7.25(s，1H)，6.96(d，1H，J=7.8 Hz)，6.80(d，1H，J=8.2 Hz)，6.37(dd，1H，J=1.9 Hz，J=8.7Hz)，6.32(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.46，162.69，162.51，148.81，148.23，145.87，129.57，125.77，120.89，115.74，112.89，107.47，106.30，103.01。

N′-(3，5-二羟基苯亚甲基)-2，4-二羟基苯甲酰肼(D8)，灰色固体，收率88%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.36(s，1H)，11.57(s，1H)，10.23(s，1H)，9.47(s，2H)，8.23(s，1H)，7.78(d，1H，J=8.6 Hz)，6.60(s，2H)，6.36(dd，1H，J=2.3 Hz，J=8.7 Hz)，6.31(d，1H，J=2.2 Hz)，6.26～6.28(m，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.57，162.83，162.41，158.85，148.54，136.03，129.81，107.60，105.44，104.74，103.02。

3，4-二羟基-N′-(4-羟基苯亚甲基)苯甲酰肼(D9)，黄色固体，收率90%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.38(s，1H)，9.88(s，1H)，9.58(s，1H)，9.21(s，1H)，8.31(s，1H)，7.52(d，2H，J=8.3 Hz)，7.34(s，1H)，7.27(dd，1H，J=1.9 Hz，J=8.2 Hz)，6.80～6.84(m，3H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.69，159.20，148.84，147.08，145.02，128.67，125.57，124.60，119.43，115.69，115.36，114.96。

N′-(2，4-二羟基苯亚甲基)-3，4-二羟基苯甲酰肼(D10)，浅褐色固体，收率55%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.67(s，2H)，9.58(s，3H)，8.46(s，1H)，7.36(s，1H)，7.30(d，1H，J=8.2 Hz)，7.25(d，1H，J=8.4 Hz)，6.83(d，1H，J=8.2 Hz)，6.31～6.37(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.48，160.61，159.60，149.25，148.60，145.23，131.55，124.00，119.66，115.43，115.19，110.75，107.72，102.82。

N′-(3，4 -二羟基苯亚甲基)-3，4-二羟基苯甲酰肼(D11)，褐色固体，收率69%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.32(s，1H)，9.29(s，4H)，8.22(s，1H)，9.23(s，2H)，8.21(s，1H)，7.34(d，1H，J=4.0 Hz，J=8.0 Hz)，7.27(dd，1H，J=4.0 Hz，J=8.0 Hz)，7.21(s，1H)，6.91(dd，1H，J=4.0 Hz)，6.76～6.82(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.60，148.78，147.70，147.25，145.67，144.97，126.02，124.63，120.31，119.37，115.54，115.31，114.93，112.60。

N′-(3，5-二羟基苯亚甲基)-3，4 -二羟基苯甲酰肼(D12)，深褐色固体，收率90%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.45(s，1H)，9.63(s，1H)，9.44(s，1H)，9.23(s，2H)，8.21(s，1H)，7.34(d，1H，J=4.0 Hz)，7.28(q，1H，J=12.0 Hz)，6.81(d，1H，J=8.0 Hz)，6.57(s，1H)，6.24～6.27(m，3H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.85，158.68，149.00，147.11，145.05，136.27，124.41，119.56，115.40，115.00，105.10，104.29。

3，5-二羟基-N′-(4 -羟基苯亚甲基)苯甲酰肼(D13)，棕色固体，收率86%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.47(s，1H)，9.90(s，1H)，9.54(s，2H)，8.31(s，1H)，7.53(d，2H，J=8.0 Hz)，6.83(d，2H，J=8.0 Hz)，6.73(s，2H)，6.41(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.07，159.32，158.35，147.80，135.72，128.77，125.41，115.68，105.69，105.44。

N′-(2，4-二羟基苯亚甲基)-3，5-二羟基苯甲酰肼(D14)，红棕色固体，收率93%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.77(s，1H)，11.55(s，1H)，9.98(s，1H)，9.62(s，2H)，8.47(s，1H)，7.26(d，1H，J=8.4 Hz)，6.75(s，2H)，6.83(d，2H，J=8.0 Hz)，6.43(s，1H)，6.35(d，1H，J=8.5 Hz)，6.32(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.9，160.80，159.68，158.59，149.34，135.14，131.66，110.68，107.83，105.87，102.84。

N′-(3，4-二羟基苯亚甲基)-3，5-二羟基苯甲酰肼(D15)，褐色固体，收率89%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.42(s，1H)，9.54(s，2H)，9.36(s，1H)，9.26(s，1H)，8.22(s，1H)，7.21(d，1H，J=1.6 Hz)，6.89(dd，1H，J=1.7 Hz，J=8.1 Hz)，6.77(d，1H，J=8.1 Hz)，6.71(d，2H，J=2.0 Hz)，6.40(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.22，158.51，148.21，148.03，145.84，135.90，126.02，120.6，115.72，112.83，105.85，105.60。

N′-(3，5-二羟基苯亚甲基)-3，5-二羟基苯甲酰肼(D16)，褐色固体，收率67%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.54(s，1H)，9.57(s，2H)，9.44(s，2H)，8.21(s，1H)，6.72(s，2H)，6.57(s，2H)，6.41(s，1H)，6.26(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.24，158.68，158.39，147.87，136.10，135.54，105.75，105.60，105.16，104.42。

1.3 化合物D1-D16与Tyr作用的实验步骤

参照文献[10]的方法并稍作调整。实验中以L-多巴为底物，曲酸为阳性对照。具体测试步骤如下：DMSO溶解待测化合物得到 20 mmol/L 的储备液，然后用pH=7.4 磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成所需浓度的溶液。反应在96 孔培养板中进行，总反应体系 300 μL。在测试体系中依次加入 111 μL PBS，6 μL Tyr，3 μL 待测样品，混匀后加入 60 μL MBTH(5 mmol/L)溶液，120 μLL-多巴(2.5 mmol/L)溶液，充分混匀后室温反应 10 min，然后往体系中加入 300 μL 乙腈终止反应；取 200 μL 混合溶液用酶标仪于 492 nm 波长下测量其吸光度，每次实验重复测试三次。最后根据下列公式计算对Tyr的抑制率。

Tyr 抑制率=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

其中，A1为加入样品和酶时混合液的吸光度；A2为加入样品而未加酶时混合液的吸光度；A3为未加样品加酶时混合液的吸光度；A4为未加样品亦未加酶时混合液的吸光度。

1.4 清除ABTS自由基(ABTS+·)实验

参照文献[11]并稍作调整。在两个 50 mL 容量瓶里分别用蒸馏水配制成 7 mmol/L 的ABTS溶液与 4.9 mmol/L 的K2S2O8溶液，然后将二者混合均匀，于室温避光条件下储存 12 h，得到ABTS+·储备液。不断用乙醇稀释储备液使其在 734 nm 处吸光度为0.70±0.02。移取 0.1 mL 不同浓度的样品溶液和 1.9 mL 的ABTS+·溶液，使样品终浓度在0.1～20 μmol/L 之间，混匀后避光反应 30 min。测定 734 nm 处的吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照。

ABTS+·清除率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%

式中：A样品为样品反应后溶液的吸光度；A对照为样品对照溶液的吸光度；A空白为空白的ABTS+·溶液的吸光度。

1.5 清除DPPH自由基(DPPH·)实验

参照文献[11]并稍作调整。在 50 mL 容量瓶里配制 0.2 mmol/L 的DPPH·溶液，避光保存。移取 0.1 mL 不同浓度的样品溶液和 1.9 mL 的DPPH·溶液，使样品终浓度在1～200 μmol/L 之间，混匀后避光反应 30 min。测定 517 nm 处的吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照。

DPPH·的清除率=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%

式中：A样品为样品反应后溶液的吸光度；A对照为样品对照溶液的吸光度；A空白为空白的ABTS+·溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 目标化合物与Tyr的作用结果

化合物D1-D16对Tyr活性的测试结果见表1。

表1 目标化合物D1～D16对Tyr活性的抑制率

由表1可知，化合物D1-D16对Tyr表现出不同的作用效果。化合物D3、D5、D7、D9、D11、D13与D16在不加L-多巴时，自身就能够被Tyr氧化而与MBTH结合成粉红色的产物，说明这些化合物本身就可以作为Tyr的底物。化合物D1、D8、D12和D15在浓度 20 μmol/L 和 200 μmol/L 时对Tyr均有一定的抑制效果，但在浓度 200 μmol/L 时它们的对Tyr的抑制率均明显低于对照药物曲酸，其中的化合物D12和D15在浓度 20 μmol/L 时具有优于曲酸的Tyr抑制活性。化合物D2和D6在浓度 20 μmol/L 对Tyr无作用，而在浓度 200 μmol/L 时对Tyr的抑制率分别为-25.6%与-17.4%，说明这两个化合物在高浓度时对Tyr有一定的激活作用。化合物D10和D13在低浓度(20 μmol/L)时对Tyr显示与曲酸相当的抑制效果，而在高浓度(200 μmol/L)时却具有一定的Tyr激活活性。从构效关系上初步分析发现，当目标化合物结构中一个苯环上的间位和对位同时含有羟基时，因与L-多巴结构相似，大多可作为Tyr的底物；当目标化合物结构中一个苯环上的两个间位同时含有羟基时，大多具有一定的Tyr抑制活性；当目标化合物结构中一个苯环上的邻位和对位同时含有羟基时，大多对Tyr有一定的激活活性。

2.2 目标化合物清除ABTS+·和DPPH·的结果

化合物D1-D16清除ABTS+·和DPPH·的IC50值见表2。

表2 化合物D1-D16对ABTS+·和DPPH·的清除效

由表2可知，所有目标化合物均有具较好的清除ABTS+·的活性，IC50值均优于对照药物抗坏血酸，其中的化合物D7、D9、D10、D11、D12、D16的活性尤为突出，大约是对照药物抗坏血酸活性的4.5～8倍。相比于ABTS+·，化合物D1-D16清除DPPH·的能力则表现出较大的差异，其中的化合物D3、D9、D10、D11、D12和D15具有优异的清除DPPH·活性，IC50值明显优于抗坏血酸；化合物D2、D6、D7的活性与抗坏血酸相当；而化合物D1、D4、D5、D8、D13、D14与D16活性则相对较差。构效关系初步分析表明，当D1-D16的结构中含有单羟基取代的苯环时，清除ABTS+·和DPPH·的活性大多较差；当D1-D16结构中一个苯环上的间位和对位同时被羟基取代时，具有优异的清除ABTS+·和DPPH·的活性；当D1-D16结构中一个苯环上的两个间位同时被羟基取代时，大多具有较差的清除DPPH·的活性，而对清除ABTS+·活性影响不大。

3 结论

以羟基取代苯甲酸甲酯、水合肼，以及羟基取代苯甲醛为原料，通过肼解、缩合两步反应，合成了16个含酚酰腙类化合物(D1-D16)，并初步测试了其与Tyr的作用以及清除ABTS+·和DPPH·的能力。结果表明，目标化合物D1-D16对Tyr表现出抑制和激活不同的作用效果，部分化合物自身可作为Tyr的底物。所有目标化合物均具有优异的清除ABTS+·的活性，IC50均强于对照药物抗坏血酸；部分化合物具有优异的清除DPPH·的活性，明显强于对照药物抗坏血酸。初步构效关系分析表明，目标化合物结构中苯环上羟基的数目和取代位置对活性有较大影响。该研究设计合成的部分含酚酰腙类化合物具有优异的抗氧化活性，可作为先导结构进一步深入研究。