马 丹，尚书游，陈欣雨，付佳欣，阮 军

（1.荆楚理工学院农业生物技术研究所，湖北 荆门 448000；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430048；3.湖北聚瑞生物科技有限公司，湖北 荆门 431900）

0 引言

铁皮石斛属兰科石斛属多年附生草本植物，属于石斛品种中的上品，味甘、微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热之功效［1-2］。 2019 年11 月25 日，国家卫生健康委发文正式将铁皮石斛纳入国家药食同源目录中［3］，研究表明石斛中的黄酮类成分具有降血脂［4］、降血糖［5-6］、镇静［7］、抗氧化［8］、抗肿瘤［9］等功能。 将铁皮石斛与其他药食同源的中药材组成复方进行功能性的研究成为时下热点，史玮琪［10］等用铁皮石斛复方粉剂（由铁皮石斛、黄芪、党参、柴胡、溪黄草、陈皮组成）对罗非鱼抗氧化性进行了研究。高大可［11］研究了铁皮石斛复方制剂（由铁皮石斛、丹参、西洋参、麦冬组成）的抗氧化性，发现铁皮石斛复方制剂对DPPH 和羟自由基均有较好的清除作用， 在16.0mg/ml 质量浓度下对DPPH 和羟自由基清除率均达到60%。 铁皮石斛复方制剂不仅具有较好的抗氧化活性而且还具有延缓衰老的潜在功能，李伯齐［12］的铁皮石斛复方由铁皮石斛、黄芪、当归、枸杞、丹参、女贞子等配伍而成，试验表明铁皮石斛复方具有延缓衰老的作用。 本研究在传统中医药理论的指导下将铁皮石斛、党参、黄芪、黄精四味药食同源的中药材组成复方［12-15］，黄芪与石斛联用时具有协同作用，使抗氧化抗衰老等作用更有效［12］；石斛与党参搭配，有健脾益肺、益气养血之功效［16］。 石斛与黄精配合以突出“补气滋阴，益脾润肺，壮肾固精”之功效［17-18］；四味药材均含有活性成分黄酮［19-22］，通过对复方石斛总黄酮的提取工艺优化，获得较高提取率，并对提取物进行抗氧化活性和降糖活性测定，为药食同源复方制剂的产品开发提供理论支持。

1 材料与仪器

1.1 材料

铁皮石斛、黄芪、党参、黄精：安徽省亳州市永和堂药业有限责任公司；亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、维生素C(VitaminC,VC)、氢氧化钠、DPPH、ABTS、硫酸亚铁、双氧水、芦丁对照品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司分析纯； 秀丽隐杆线虫野生型线虫株系N2： 明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传学中心CaenorhabditisGeneticsCenter（CGC）；葡萄糖试剂盒、甘油三酯试剂盒、蛋白质（BCA）测定试剂盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 仪器

LD-96A 酶标仪：中国莱恩德智能科技有限公司；SPX-250B 生化培养箱：中国立辰科技有限公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计：中国北京普析通用仪器有限责任公司；FA124 电子分析天平：中国上海力辰邦西仪器科技有限公司；大容量冷冻离心机：中国湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；台式超声波清洗机：中国宁波新芝生物科技股份有限公司。

2 试验方法

2.1 复方石斛提取液的制备

首先将铁皮石斛、党参、黄芪、黄精进行冷冻干燥预处理，粉碎过80 目筛后，依据预实验结果将复方石斛（铁皮石斛-党参-黄芪-黄精=2 ∶3 ∶3 ∶2）按比例混合均匀，放于干燥器中待用。 称取混合粉末2.0g于圆底烧瓶中，按料液比1:20（g:ml）加入60%的乙醇，超声提取30min，8000r/min 离心10min 得上清液，并用提取溶剂补至同一体积，即得复方石斛提取液。

2.2 芦丁标准曲线的绘制及提取液总黄酮含量测定

参考刘玉明［23］的方法，稍作调整。 精密称取芦丁标准品0.032g，放入100ml 容量瓶中，加入60%的乙醇，超声溶解并定容，即得芦丁对照品贮备液溶液。分别量取芦丁贮备液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml于25ml 容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml，放置约6min，加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，放置约6 min，加入4%氢氧化钠溶液4ml，用60%乙醇定容，摇匀放置15 分钟，在510nm 处测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，芦丁标准品溶液浓度为横坐标绘制A~C 曲线。 对标准曲线进行线性拟合的回归分析方程：y=12.592x-0.0015，相关系数R2=0.9993，表明样品浓度在0.006~0.0362mg/ml 范围内呈现较好的线性相关性。

取复方石斛提取液5ml，同标准曲线制备方法操作，测得吸光度值，代入标准曲线回归方程计算总黄酮得率。

其中：x 为黄酮含量（mg/ml）；m 为混合干粉质量（g）；V 为提取液体积（ml）；y 为总黄酮得率。

2.3 单因素试验

准确称取2.00 g 混合粉末，固定提取温度25℃，超声功率200 W，分别在不同乙醇浓度（0%、30%、40%、50%、60%、70%)、不同提取时间（5、15、25、35、45、50min）和不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）条件下进行提取，分别考察乙醇浓度、提取时间、料液比对复方石斛总黄酮得率的影响。

2.4 响应面试验设计

结合单因素试验结果，根据Box-Behnken 设计原理，采用响应面法进一步优化复方石斛总黄酮提取工艺。 利用Design-Expert10.0 软件以黄酮得率为响应值设计3 因素3 水平的实验方案进行分析，响应面因素水平如表1 所示。

表1 响应面因素水平表

2.5 体外抗氧化活性测定

2.5.1 自由基清除能力测定

2.5.1.1 VC 溶液的DPPH 自由基清除率

精确称取10.0 mg VC，纯水溶解，定容至1000 ml 的VC 贮备液。 分别量取VC 贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml，用无水乙醇补足体积至2 ml，再加入2 ml 浓度为0.1 mmol/l 的DPPH 自由基乙醇溶液于试管中混匀，避光静置30 min，以2 ml 无水乙醇代替VC 溶液作为空白，在波长517 nm 处测定吸光度值。 VC 溶液吸光度值记为A，空白对照吸光度值为A0。 VC 溶液的DPPH 自由基清除率（Y）计算公式如下：

以VC 溶液浓度C 为横坐标，抑制率Y 为纵坐标，拟合直线方程，计算得到VC 的IC50（半抑制浓度）。

2.5.1.2 样品的DPPH 自由基清除率

采用最优工艺提取复方石斛总黄酮， 所得提取液测定含量后， 分别吸取0.3、0.36、0.42、0.48、0.54、0.60 ml，用无水乙醇补足体积至2 ml，加入2 ml 0.1 mmol/l 的DPPH，避光静置30 min 后在517 nm 处测定吸光度值A1，将前述各样品溶液中的DPPH 用无水乙醇替代，测定吸光度为A2，2 ml 无水乙醇和2 ml DPPH 溶液测得吸光度A0，样品溶液的DPPH 自由基清除率（Y）计算公式如下：

2.5.2 ABTS+自由基清除活性测定

2.5.2.1 ABTS+自由基工作液配制

取0.2 ml ABTS 二铵盐储备液（7.4 mmol/l）和0.2 ml K2S208 储备液混合（2.6 mmol/l），黑暗环境下室温放置12 小时，用无水乙醇将混合液稀释40~50 倍直至吸光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS+自由基工作液。

2.5.2.2 样品工作液配制

取样品液（黄酮含量0.0328 mg/ml）10 ml 放入50 ml 容量瓶内，加入纯水至刻度线，配成样品工作液（6.56 μg/ml）备用。

2.5.2.3 VC 工作液配制

精密称量10.0 mg 的VC，蒸馏水使其充分溶解后，定容至10 ml，再取1 ml VC 溶液定容至100 ml配成VC 工作液（10.0 μg/ml）备用。

2.5.2.4 VC 的ABTS+抑制率标曲的制备

依次取200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL VC 工作溶液于试管中，依次加入1800 μL、1750 μL、1700 μL、1650 μL、1600 μL、1550 μL 无水乙醇， 分别加入ABTS+自由基工作液2 ml 于试管中混匀，以无水乙醇作参比液，在波长734 nm 处测定吸光度A。 2.0 ml 无水乙醇和2.0 ml ABTS 自由基工作液混合均匀，测吸光度值A0，以VC 浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制回归曲线。

2.5.2.5 样品的ABTS+抑制率曲线制备

依次取200 μl、400 μl、600 μl、800 μl、1000 μl、1200 μl 样品工作溶液于试管中，再依次加入1800 μl、1600 μl、1400 μl、1200 μl、1000 μl、800 μl 无水乙醇， 再分别加入ABTS+自由基工作液2 ml 于试管中混匀，以无水乙醇作参比液，在波长734 nm 处测定吸光度A。 以2 ml 无水乙醇和2 ml ABTS+自由基工作液混合均匀，测吸光度值A0，以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制回归曲线。ABTS+自由基清除率（Y）计算公式如下：

2.5.3 羟基自由基清除率的测定

样品工作液和VC 工作液配制方法同2.5.2， 依次取200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl、1200μl 样品工作溶液于试管中，加蒸馏水补足至2.0ml，加入500μlFeSO4(6mmol/l)，1000μlH2O2(6mmol/l)，充分振摇，放置10min；加入500μL 水杨酸（6mmol/l)，充分振摇，室温放置30min。 510nm 处测定吸光度，重复3 次，取平均值，VC 作为阳性对照。

式中：A0 为空白对照，500μL 蒸馏水代替样品；A1 为样品吸光度，A2 为不加双氧水的吸光度值。

2.6 复方石斛提取物对秀丽隐杆线虫体内降糖活性的测定

2.6.1 线虫药物制备

按最优工艺得到的复方石斛提取液进行冷冻干燥得到干燥粉末， 分别称取粉末， 加二甲基亚砜溶解，微孔滤膜过滤，制备成浓度为60、120、240mg/ml 的样品溶液各三份，分别命名为60-1、60-2、60-3、120-1、120-2、120-3、240-1、240-2、240-3。

2.6.2 线虫培养

采用液体培养法用96 孔板培养。 每孔加入100μlS-complete 培养基，其中设置仅含有2%D-葡萄糖的高糖对照组，以及添加不同浓度药物和2%D-葡萄糖的高糖处理组。 培养线虫至成虫第三天，收集不同处理组的线虫用M9 缓冲液洗3 次去除黏附的杂菌，在冰上充分研磨，再在4℃下10000rpm 离心5 min，按照葡萄糖、BCA 测定试剂盒说明书步骤测定线虫匀浆液上清中葡萄糖、蛋白质含量，每个实验重复三次。 按试剂盒测定步骤操作，得蛋白标准曲线方程为Y=0.0147x+0.1136（R2=0.9993），将测定的空白孔和样本孔吸光度值代入标准曲线方程，得到各样本蛋白质含量。 根据葡萄糖测试盒测定步骤操作，测定各空白孔、标准孔和样本孔吸光度值，并代入下列计算公式得到葡萄糖含量。

2.7 数据处理

数据通过Design-Expert10.0 软件和Excel 进行处理分析。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 不同料液比对黄酮得率的影响

考察不同料液比对复方石斛总黄酮得率的影响发现，随着料液比从1∶15 到1∶35 变化时，黄酮得率随着溶剂体积增加而增大。 在1∶35 时达到最大值2.33%，该复方石斛总黄酮得率略低于单一的紫皮石斛总黄酮提取率［24］。 但继续增加溶剂体积为1:40 时其得率为1.99%，黄酮得率稍微降低。 这是因为溶质的溶出速率与浓度梯度呈正相关，浓度梯度越大，溶出速度越快，相同时间内溶出量越多。在相同料液比下，复方石斛总黄酮得率均高于铁皮石斛花总黄酮得率［25］。 因此，在相同的提取时间内，随着料液比的增加，浓度梯度增大，黄酮溶出增加。当料液比为1∶35 时大部分黄酮都已溶出，继续增加溶剂的量，得率不再继续增加。 因此选择1 ∶30 与1∶40 为最低和最高水平进行响应面分析实验。

图1 不同料液比对黄酮得率的影响

3.1.2 不同醇浓度对黄酮得率的影响

考察不同乙醇浓度对复方石斛总黄酮得率的影响发现，随着乙醇浓度的增加，复方石斛总黄酮得率在乙醇浓度为60%时达到最高，为2.54%。这是由于黄酮在植物中主要以苷的形式存在，分子有一定的极性，乙醇溶液随浓度增加，极性减弱。当乙醇浓度增加到60%时，大多数黄酮处于这个极性范围，溶出增加。 当继续增加乙醇浓度，溶剂极性进一步降低，总黄酮溶出减少，而弱极性物质溶出增加。 也有可能是因为乙醇浓度增加导致细胞内蛋白质发生凝固，阻碍黄酮溶出［26-27］，因此60%乙醇为最佳值。

图2 不同醇浓度对黄酮得率的影响

3.1.3 不同超声时间对黄酮得率的影响

考察不同提取时间对复方石斛总黄酮得率的影响发现，5-35 min 时，随提取时间增加，总黄酮得率增速较快。 在45 min 时达到峰值，50 min 时有所降低，该结论与唐静月等［25］的研究结论相似。 表明提取时间少于45 min 时，黄酮在料液比1 ∶20(g:ml)的提取溶剂中未完全溶出。 同时由于黄酮中酚羟基易氧化，时间继续延长，导致黄酮氧化后失去还原能力，含量测定时吸光度值变小，从而得率测定值下降。 综合考虑选择提取时间在30、40、50 min 进行下一步优化。

图3 不同超声时间对黄酮得率的影响

3.2 响应面试验结果

3.2.1 响应面数据分析

根据单因素实验的结果分析，运用Box-Behnken 响应面优化方法，设计3 因素3 水平试验，对乙醇浓度A、超声时间B、液料比C 这3 个因素进行优化，结果见表2、表3。

表2 响应面试验设计及结果

表3 模型的显著性检验及方差分析

用Design Expert10.0.1 进行实验设计，优化出17 组试验，进行回归拟合得到复方石斛总黄酮得率的二次多项回归方程为：Y=＋2.27 ＋0.19 A ＋0.54 B ＋0.13 C-0.15 AB －0.16 AC ＋0.11 BC －0.17 A2－0.13 B2－0.37 C2

分析二次多项回归方程，一次项系数绝对值大小顺序为：B>A>C，可得出影响复方石斛总黄酮得率的因素顺序为超声时间B>乙醇浓度A>液料比C。

由表3 可知，该回归模型P<0.01，同时失拟项P=0.9693>0.05，失拟项无显著性差异，回归系数R2=0.9722,R2Adj=0.9366，说明该模型具有较高的可信度，回归方程可以很好地预测复方石斛总黄酮提取的最佳工艺。

该模型中一次项乙醇浓度A、超声时间B 和二次项C2的P 值均<0.01，一次项C、二次项AC 和A2的P 值<0.05。 说明乙醇浓度和料液比的交互作用对复方石斛总黄酮提取率有显著影响，并且乙醇浓度和料液比这两个因素对响应值的影响不是简单的线性关系， 而是存在一定交互作用。 由三个因素的F值的大小可知，影响复方石斛总黄酮得率的因素顺序是B（超声时间）>A（乙醇浓度）>C（料液比）。而乙醇浓度和超声时间的交互项AB、超声时间和料液比的交互项BC 的P 值>0.05，说明这两个交互项对结果影响不显著。

响应面曲线的坡度陡峭程度可以反映各个影响因素对响应值的影响大小，响应面的坡度越陡峭，表明两因素交互作用明显；反之两因素交互不明显。由交互作用图可知，AC 即料液比与乙醇浓度交互作用曲面最陡，因此其交互作用最为显著，与方差分析结果一致。

图4 复方石斛抗氧化能力交互作用图

3.2.2 复方石斛总黄酮提取工艺验证

通过Design-Expert 软件对复方石斛总黄酮提取的优化试验结果， 得出最佳提取工艺为当乙醇浓度为59.561%，超声时间47.034 min，液料比为36.535 时，总黄酮提取率达到最大值2.613%。 根据表3的显著性分析，为了方便试验操作，将试验条件修正为：乙醇浓度60%，超声时间50 min，液料比为35，在该条件下重复三次试验，总黄酮提取率平均为2.59%，与理论值接近。

3.3 复方石斛提取物体外抗氧化活性

3.3.1 DPPH 自由基清除能力

在最佳工艺条件下制备复方石斛提取液，配制梯度浓度后分别测定其DPPH 抑制率，测定结果见图5。 通过拟合的直线方程计算出复方石斛提取液对DPPH 的IC50 为7.189 μg/ml，阳性对照组VC 测定结果IC50 为1.292 μg/ml，复方石斛提取液的抗氧化活性略逊于VC，但其仍具有可观的清除能力。 随着提取液浓度的增加，对DPPH 的抑制率也逐渐增强。当提取液浓度达到9.84 μg/ml 时，DPPH 自由基清除率为80.65%。 在相同浓度下该复方石斛提取液的DPPH 自由基清除能力优于高大可等[11]人的复方石斛提取液。

图5 复方石斛和VC 对抗氧化活性的影响

3.3.2 ABTS 自由基清除能力

由图6 可知，随着样品浓度的增加，其ABTS+自由基清除率缓慢增加。当抑制率为50%时，VC 浓度约为1.1340 μg/ml，样品浓度约为1.288 μg/ml，可以看出，两者对ABTS+的抑制活力比较相近。在一定浓度范围内的同一浓度下，VC 的ABTS+自由基清除能力高于复方石斛提取液。 当样品浓度为3.96 μg/ml时，抑制率达到93.95%。

图6 ABTS 自由基清除能力

3.3.3 羟基自由基清除能力

由图7 可以看出，当抑制率为50%时，VC 浓度约为1.079 μg/ml，样品浓度约为1.468 μg/ml，二者对羟基自由基的抑制活性比较接近，但是VC 对羟基自由基清除效果更好。该结果与王林青等［28］人的研究结果一致。 当样品浓度为3.936 μg/ml 时，对羟基自由基的抑制率达到了94.37%，表明复方石斛提取液具有较好的羟基自由基清除能力。

图7 羟基自由基清除能力

3.4 复方石斛提取物对秀丽隐杆线虫体内降糖活性的测定

BCA 浓度测定和葡萄糖含量测定结果见表4，空白组的葡萄糖含量均高于其余组，表明复方石斛提取液对秀丽隐杆线虫具有降糖作用。 当提取物制备成120 mg/ml 的溶液时，被线虫摄取后产生较好的降糖活性，其葡萄糖含量为0.03 mmol/g，蛋白含量为6.08 μg。 葡萄糖含量随着样品浓度的增加而先降低，后升高。 表明样品浓度过高反而会降低复方石斛提取液的降糖作用。

表4 BCA 浓度测定和葡萄糖含量测定

4 结论

本研究是以复方石斛（铁皮石斛－党参－黄芪－黄精=2:3:3:2）为原料进行总黄酮的提取，通过单因素实验和响应面法对提取工艺进行优化， 得出复方石斛总黄酮的最优提取工艺条件为乙醇浓度60%，超声时间50 min，液料比为35，总黄酮提取率为2.59%。 并测定了提取物体外抗氧化活性和体内降血糖活性。 结果表明， 测定其对DPPH、ABTS+、 羟基自由基的半数抑制率分别为7.189 μg/ml、1.288μg/ml、1.468 μg/ml， 其与阳性对照VC 的DPPH 抑制活性相差较大， 但是增大浓度后， 最大抑制率达到80.65%，对ABTS+和羟基自由基的抑制活性与VC 较接近，最大抑制率分别可以达到93.95%和94.37%。 采用线虫实验测定其体内降糖活性，当提取物制备成120 mg/ml 的溶液时，有较好的降糖活性。 在该工艺条件下所得提取物具备抗氧化活性的同时也有一定的降糖活性。 本研究为开发多功能保健食品提供了研究思路，如延缓衰老的食品等。