黄天意，高 海，夏 鸿，邱 滢

（荆楚理工学院医学部，湖北 荆门 448000）

0 引言

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是一种常用于口腔修复的高分子材料，具有价格便宜、可操作性强、可接受的美学性能和生物相容性等优点。 但是由于PMMA 修复体长期处于口腔这个特殊的微环境，唾液浸泡叠加多变的咬合力刺激，修复体破损、折裂的情况屡见不鲜。

晶须是一种在人工调控下具备固定尺寸比例的短纤维，具有高弯曲强度和弹性模量等优点，因此常被用作增强剂以改善复合材料的物理、机械性能［1］。 钛酸钾晶须分子式写作K2O·nTiO2（n=1，2，4，6，8），其物理化学性质、结构会随着n 值不同而发生变化。 其中当n=6 时，形成的六钛酸钾晶须（K2O·6TiO2）加工性价比较高且性质优良， 是选择优先级较高的复合材料增强剂之一， 本文选择的钛酸钾晶须亦是K2O·6TiO2［1-2］。 六钛酸钾晶须具有特殊的隧道式结构，化学性质稳定，已有多项研究证实利用其增强的复合材料相比于原材料机械强度有显著提升［3-5］。 但是钛酸钾晶须尺寸细微，具有较高的比表面积和表面能，致其相比于普通纤维更不容易均匀分散到基质中，因此学者们常采用表面处理的方法弥补这一缺陷，期望可使复合材料机械强度进一步提升［3，6］。基于此，在前期实验中本课题组尝试采用硅烷偶联剂对钛酸钾晶须进行表面处理，之后将其导入PMMA 中，证实所得钛酸钾晶须改性PMMA 材料的弯曲强度和弹性模量可显著上升［3］。

生物相容性是医疗器械进入临床应用前需要考察的重要指标之一。 PMMA 已进入临床多年，多项研究证实其具有可接受的生物相容性， 但实际应用中其单体聚合不完全等因素仍可能引起口腔组织损伤［3,7-8］。而关于钛酸钾晶须在生物相容性方面的报道也层出不穷，Qi Yumin 等［9］发现成骨细胞可在钛酸钾生物薄膜上正常生长增殖，但Abdelgied M 等［10-11］和Horie M 等［12］等人分别通过体外、体内实验证实钛酸钾晶须刺激可引起细胞内多种炎性因子过表达，进而引发炎症反应。鉴于本实验合成采用的原料均有引起细胞损伤的可能，且钛酸钾晶须的加入是否可能导致PMMA 单体渗出增多，进而加重细胞损伤等问题暂不明确， 本实验期望通过探究钛酸钾晶须改性PMMA 材料对L929 细胞细胞增殖与氧化损伤的影响，初步探究其生物相容性，为未来可能的临床应用打下基础。

1 仪器和材料

1.1 主要仪器

QM-3SP2 型行星式球磨机（南京大学仪器厂）； 电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ320ODB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；电子天平（Precisa）；CO2恒温培养箱（SANYO，日本）；酶标仪（Rayto，美国）离心机（Eppendorf，美国）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，日本）。

1.2 主要试剂

日进“自然”系列PMMAⅡ型粉1R 仿生物色（日进齿科材料有限公司剂）；硅烷偶联剂KH-570（南京创世化工助剂有限公司）；K2O·6TiO2钛酸钾晶须（上海凯射丰实业有限公司）；冰醋酸（山东德彦化工有限公司）；无水乙醇（山东德彦化工有限公司）；H-DMEM 液体培养基（Gibco，美国）；青霉素链霉素溶液（PAA，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；胰蛋白酶（Hyclone，美国）；MTT 试剂盒（Amresco，美国）；DCFH-DA（上海贝博生物技术有限公司）。

1.3 细胞系

小鼠成纤维细胞L929 细胞系（上海中科院）。

2 实验方法

2.1 钛酸钾晶须表面处理

把无水乙醇和蒸馏水按照9∶1 的质量配比混合，使用冰醋酸调节混合溶液至pH=4，以5%的质量分数将KH-570 加入混合液，超声震荡约30 分钟使KH-570 预水解。 以质量比1∶5 将钛酸钾晶须溶于蒸馏水中，震荡，快速搅拌使之均匀分散为悬浊液。 保持搅拌速度不变的同时向悬浊液中加入已预水解的KH-570，配比为钛酸钾晶须质量的3%。继续搅拌15min 后静置30min，过滤去上清液后置于50℃烘箱干燥1d，打散，钛酸钾晶须表面处理完成。

2.2 试件制作

把上述经过硅烷偶联剂表面处理的钛酸钾晶须以10%的质量分数配比加入PMMA 粉母料中，置入球磨仪持续研磨1h 使二者均匀混合，作为改性材料实验组，PMMA 母料为PMMA 对照组。 按照原母料说明书，在室温约23℃左右条件下，按规定粉液比例将两组粉末与单体均匀混合，在面团期压入标准模具（25mm×5mm×2mm），待其硬固后取出，打磨抛光，备用。

2.3 浸提液制备

将两组试件分别超声清洗30min 后，转移至超净台中，分别置于做好标记的6 孔板中加75%乙醇浸泡35min，无菌PBS 冲洗3 遍，紫外灯照射大于1h，待两组试件自然干燥。 按照浸提液制取标准，以1 g/5mL 的比例，加入提前配制的培养基（DMEM 高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗），置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）内，24 小时后收集培养基即为两组试件浸提液，标记并置于4℃冰箱保存。

2.4 实验分组

阴性对照组：DMEM 高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗；

PMMA 组：PMMA 试件浸提液；

改性材料组：钛酸钾晶须改性PMMA 材料试件浸提液。

2.5 细胞培养

实验对象选取小鼠成纤维细胞（L929），取冻存，复苏，使用DMEM 高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗在恒温培养箱（37℃、5%CO2）中连续培养。24h 换液一次。换液前观察细胞活力与生长状态，当细胞密度达到约80%～85%时，进行传代培养。

2.6 细胞增殖检测

选取对数生长期L929 细胞，接种至96 孔板中，每孔约3×103个细胞，每组6 个重复孔，放回原恒温培养箱中过夜培养。 待细胞贴壁状态良好，更换各组培养液为浸提液，共培养24h。 检测之前，吸弃原有浸提液，每孔加入混有20μLMTT 试剂的DMEM 高糖培养基200μL（含10%血清和1%双抗），放回原恒温培养箱继续培养4h，之后小心吸弃孔中液体，PBS 漂洗后加入150μL 二甲基亚砜，震荡10min，待每个孔溶液颜色稳定时，使用荧光酶标仪检测在490nm 波长下的吸光度（OD）值。

2.7 ROS 检测

选取对数生长期L929 细胞，将细胞接种至黑壁（防止孔壁荧光渗漏）96 孔板中，每孔约2×104个细胞，每组6 个重复孔，放回原恒温培养箱中继续培养24 小时。吸弃原有培养基，加入各组浸提液，再次放回原恒温培养箱继续培养24h。 吸弃孔中液体，PBS 洗涤两次，每孔加入10μM 的DCFH-DA，放回原培养箱避光处理30min，PBS 洗涤细胞3 次，使用荧光酶标仪检测荧光强度（激发波长488 nm；发射波长525nm）。

2.8 统计学分析

每个实验重复3 次以上，数据采用均值±标准差表示。 并使用SPSS Statistics22 进行数据分析，采用单因素方差分析、S-N-K 和LSD 检验，比较各组之间是否存在差异，当P<0.05 时，说明存在统计学差异。

3 实验结果

3.1 不同浸提液染毒L929 细胞后细胞增殖结果

MTT 法检测细胞增殖是对材料细胞毒性评价最常用的指标之一，简而言之，我们可以通过所得OD值的大小判断细胞数目的多少。 按照公式：细胞增殖率=（各组平均OD 值/阴性对照组的平均OD 值）×100%计算细胞增殖率，各组各组相对OD 值、细胞增殖率(%)和毒级如表1 所示。

表1 各组相对OD 值、细胞增殖率(%)和毒级表

由表1 可知，PMMA 组和改性材料组的细胞增殖率相对于阴性对照组都有所降低，依次为84.7%、85.3%，但根据ISO 标准，细胞毒性为0 级。 进一步通过单因素方差分析，发现两组与阴性对照组之间存在显著的统计学差异（P<0.001），但PMMA 组和改性材料组之间无统计学差异（P>0.05）。

3.2 不同浸提液染毒L929 细胞后ROS 检测结果

使用DCFH-DA 探针检测各组浸提液作用于L929 细胞后ROS 表达量变化， 以阴性对照组为标准计算ROS 相对表达量：相对表达量=（各组平均荧光强度/阴性对照组的平均荧光强度）×100%，结果如表2 所示。

表2 ROS 相对表达量表

由表2 可知，PMMA 组和改性材料组相比于阴性对照组分别增加45.9%、37.8%，通过进一步统计分析，发现两组与阴性对照组之间的差异有显著的统计学意义（P<0.001），但PMMA 组和改性材料组之间无统计学差异（P>0.05）。

4 讨论

近年来，关于口腔修复新材料的报道层出不穷，例如聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯等，但是PMMA 仍然是在口腔修复临床治疗中使用频率最高的义齿基托材料之一［13-14］。 面对PMMA 仍然存在少许瑕疵这个现实问题，众多学者尝试利用纳米银粒子、石墨烯、纳米金刚石等物质对其进行改性，期望达到锦上添花的效果［15］。 本课题组前期实验尝试利用钛酸钾晶须强化PMMA，成功合成复合材料并证明在钛酸钾晶须质量分数为10%时复合材料机械强度达到峰值［3］。为深入研究复合材料的性质，本研究尝试利用其浸提液与L929 细胞共培养，探究其对L929 细胞增殖及氧化损伤的影响，进而论证钛酸钾晶须改性PMMA 的生物相容性。

本研究通过MTT 法检测了钛酸钾晶须改性PMMA 材料对L929 细胞增殖的影响， 参照标准（ISO 10993-5）： 经计算后细胞增殖大于75%认定为无细胞毒性，50%～75%为细胞毒性轻微，25～50%为中度的细胞毒性，小于25%为高度细胞毒性。本次实验PMMA 组和改性材料组细胞增殖率均大于75%，证明其无细胞毒性。关于PMMA 的细胞毒性评级，与Zhou Wen 等［16］和Salim S A 等［17］研究结果一致，但Jiao Yang 等［18］却认为PMMA 存在细胞毒性，初步分析可能是由于实验采用的PMMA 母料或细胞株不同导致的实验结果差异； 与之相似的是本次实验PMMA 组和改性材料组均与阴性对照组有显著差异 （P<0.001），说明其对L929 细胞增殖确有抑制作用，只是暂未达到细胞毒性的范畴。

ROS 在机体内有多种表现形式，例如羟自由基（·OH）、超氧阴离子、过氧化氢（H2O2）等，其在细胞和机体的各种生理和病理调节过程中扮演着重要角色［19-20］。 ROS 可分为内源性和外源性，正常情况下，细胞自身产生的ROS 为内源性ROS，如线粒体氧化磷酸化过程中产生的ROS，而因治疗、环境暴露等因素而增加的ROS 一般为外源性ROS［20］。 相对低水平的内源性ROS 可作为第二信使激活某些酶促反应或转录因子，调控细胞的代谢，促进细胞增殖。 但某些外源性ROS 常超出机体缓冲能力，可通过非酶促糖基化作用介导脂质过氧化、DNA 和蛋白质等大分子损伤［21-22］。 研究发现PMMA 浸提液刺激可使细胞ROS 生成显著增加，与Zhang Yu 等［7］实验结果一致，说明PMMA 可能存在潜在的致炎能力。 与此同时，改性材料组也显示出ROS 水平显著上升（P<0.001），但与PMMA 组无统计学差异，说明钛酸钾晶须的加入对原PMMA 材料的致炎能力无明显影响。

综上所述，使用经硅烷偶联剂表面处理的钛酸钾晶须改性PMMA 材料，在不影响其生物相容性的基础上，显著地提升了复合材料的机械强度，表明钛酸钾晶须改性PMMA 材料具有一定临床应用的潜力。