王源钊 张文昊 杨 劲 吴伟航 方永超 赵 虎 林 楠 王 蓉 王 瑜

(厦门大学附属东方医院 联勤保障部队第九〇〇医院普通外科,福州 350025)

随着新辅助放化疗(neoadjuvant chemoradiotherapy,nCRT)手段的进步,中低位局部进展期直肠癌(locally advanced rectal cancer,LARC)(Ⅱ、Ⅲ期)nCRT后的退缩模式及安全远端切缘长度备受关注。直肠癌nCRT后存在3种主要退缩模式:肿瘤碎片化、肿瘤整块收缩、黏液湖形成,且3种模式可同时存在[1,2]。肿瘤碎片化(点灶性收缩)存在于约80%的患者中,导致肿瘤大体和镜下退缩不同步[1,3]。美国结直肠外科医师协会(American Society of Colon and Rectal Surgeons,ASCRS)制定的ASCRS Manual of Colon and Rectal Surgery建议直肠癌行nCRT后的手术范围应将原发肿瘤区域完全切除(原位切除),防止碎片化活癌细胞残留[4]。

对于nCRT后瘤体缩小甚至达到临床完全缓解(clinical complete remission,cCR)的LARC,因肿瘤下缘及周围正常组织收缩上移,术前MRI检查并不能指导原发肿瘤位置[5]。此外,腹腔镜手术中大多无法观察到直肠内缩小的肿瘤的具体位置,且肠管经放疗后纤维化水肿增厚,术中肛门指诊常阴性,多数术者仅凭主观经验进行手术,容易造成远端切缘不足,或无法做到原位切除。纳米炭混悬液可长时间标记结直肠息肉样病变,局部注射后12个月在原位仍可见黑染标记,且标记后无不适反应[6]。因此,2020年1月～2023年1月,我们选择46例中低位LARC,于nCRT前内镜下应用纳米炭标记肿瘤下缘,nCRT后行腹腔镜直肠前切除术,观察纳米炭是否可长时间标记原发肿瘤下缘,并分析其辅助nCRT后直肠癌原位切除的可行性及有效性。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性单臂研究,通过联勤保障部队第九〇〇医院生物医学伦理委员会审批(伦审科第2020-004号)。

病例纳入标准:①年龄>18岁;②经肠镜活检确诊为直肠腺癌;③首次MRI显示肿瘤下缘距离肛缘<10 cm且肿瘤cTNM分期为Ⅱ～Ⅲ期[美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第8版][7],符合nCRT指征且同意行nCRT;④同意在nCRT前对肿瘤下缘进行内镜纳米炭标记;⑤nCRT后肿瘤退缩,并顺利完成腹腔镜直肠前切除术。

排除标准:①出现肝、肺、腹膜等远处转移;②腹部大手术史或肠粘连严重;③nCRT后肿瘤无退缩或肿瘤进展;④手术中转开腹或行腹会阴联合切除或经肛入路手术;⑤临床病理资料不全。

符合纳入标准的患者连续入组形成连续性病例队列,共有76例Ⅱ～Ⅲ期LARC行内镜纳米炭标记,其中3例因无法耐受化疗不良反应终止nCRT,14例nCRT后瘤体无缩小或疾病进展,予排除。剩余59例中7例行腹会阴联合切除术,4例经肛行括约肌间切除术,2例因术中出血中转开放手术,予排除。

最终nCRT后完成腹腔镜直肠前切除术共46例进入数据分析,nCRT前临床基线资料:男27例,女19例,年龄63(29～78)岁,BMI 22.04(18.03～29.40)。主要症状为排便次数增多伴便中带血32例,排便不畅4例,间断中下腹痛5例,无症状体检发现5例。肠镜病理高级别上皮内瘤变伴癌变10例,中分化腺癌31例,低分化或黏液腺癌5例。MRI报告低位直肠癌20例,中位直肠癌26例,临床分期Ⅱ期12例,Ⅲ期34例,肿瘤浸润肠腔2/3(1/4～1)圈,肿瘤长径(4.6±1.0)cm,肿瘤下缘距离肛缘5.6(3.4～9.0)cm。

1.2 纳米炭标记方法

试剂:纳米炭混悬注射液(卡纳琳)(1 ml: 50 mg,重庆莱美药业股份有限公司,国药准字H20073246);玻璃酸钠注射液(2.5 ml: 25 mg,上海景峰制药股份有限公司,国药准字H20000643)。

标记方法:nCRT前1周内由同一位内镜医师行内镜纳米炭混悬液标记。常规肠道准备,侧卧收膝位,电子肠镜找到肿物,定位肿瘤下缘,于病灶肛侧距病灶边缘约1 cm环周选取4点,用23G内镜注射针在这4点黏膜下层斜30°～45°各注入1 ml玻璃酸钠盐水混合液使黏膜抬起,再各注射纳米炭混悬液0.1 ml,共0.4 ml,检查直肠黏膜无出血(图1A～D)。

图1 4例患者新辅助放化疗前后纳米炭标记对比:A～D.新辅助放化疗前纳米炭标记:距肿瘤下缘1 cm处环周选取4点,每点注射纳米炭混悬液0.1 ml;E～H. 上图4例患者新辅助放化疗结束后肠镜检查,肿瘤明显缩小,距纳米炭注射时间间隔分别为98 d、106 d、110 d、113 d,纳米炭残迹仍清晰可见 图2 术中游离直肠可见纳米炭显露在直肠固有筋膜上(A.直肠前壁,B.直肠左侧壁),在纳米炭显露处边缘行肠管裸化(B、C) 图3 离体标本测量:标本离体后立即沿肠管纵轴肿瘤对侧剪开标本,暴露出原发肿瘤区域(黄虚线标识)、肿瘤瘢痕(绿虚线标识)、原发肿瘤下缘退缩区、远端切缘、纳米炭标记区(箭头),并进行测量记录 图4 术后病理HE染色(大图放大20倍,小图放大200倍):A.直肠周围黑染淋巴结;B.直肠癌标本纳米炭区域,可见纳米炭颗粒渗透直肠壁全层,与肠壁各层呈30°～45°,向周围弥散极少(蓝圈内示纳米炭颗粒)

1.3 nCRT方案

均采用同步放化疗。

放疗采用传统分割(长程)方案,三维适形放疗,45～50.4 Gy/(1.8～2.0)Gy×(25～28)次,总时间5～6周。放疗技术:6MV-X线调强放射治疗(intensity modulated radiotherapy,IMRT)。放射靶区:0.5 cm层厚增强CT扫描定位,MRI平扫T2加权,CT/MRI融合勾画靶区,包括直肠肿瘤病灶和直肠及系膜区、骶前区、髂内淋巴结、闭孔淋巴结等淋巴结引流区。

化疗方案:根据中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)结直肠癌诊疗指南推荐[8],综合考虑年龄、身体状况、合并基础疾病等因素个体化选择同步化疗方案,其中卡培他滨单药方案24例,奥沙利铂联合卡培他滨(CAPEOX)方案11例,伊立替康联合卡培他滨方案6例,奥沙利铂联合氟尿嘧啶和亚叶酸钙(mFOLFOX6)方案5例。每3周进行一周期化疗,共2～6周期。

1.4 手术方法

均遵循直肠全系膜切除(total mesorectal resection,TME)原则行腹腔镜直肠前切除术(Dixon手术),手术由本治疗组具有10年以上且每年40台以上直肠癌根治术经验的胃肠外科医师完成。常规五孔法,沿直肠固有筋膜充分游离直肠系膜至终点线,注意保护沿途血管、神经。41例可见纳米炭标记显露在直肠固有筋膜表面(图2A、B),通过纳米炭标记范围确定直肠远端离断缘,中位直肠癌远端离断缘距纳米炭标记中心至少1 cm(图2B),低位直肠癌在纳米炭标记边缘处行肠管裸化(图2C)。5例术中未见纳米炭标记显露,通过内镜经肛观察纳米炭标记残迹确定手术远端离断缘位置。使用双吻合器技术离断直肠并行结肠-直肠吻合或结肠-肛管吻合,吻合口组织常规送术中冰冻病理,病理结果为阴性后关闭腹腔。

1.5 标本处理

直肠癌标本离体后,立即将标本展平,沿直肠纵轴肿瘤对侧剪开直肠,暴露出收缩后的肿瘤瘢痕区域,并判断原发肿瘤区域(肿瘤瘢痕周围环形区,60%～70%的手术标本可见,对比MRI矢状位T2加权图像肿块区域进行描绘),使用刻度尺测量切除肠管长度、原发肿瘤区域长径、肿瘤瘢痕直径、原发肿瘤下缘与远端切缘的距离(远端切缘长度)、原发肿瘤下缘与肿瘤瘢痕下缘的距离(肿瘤退缩长度)及纳米炭标记区宽度(图3A～C)。分拣直肠周围淋巴结,计数淋巴结个数和纳米炭黑染淋巴结个数。将所获得的淋巴结和手术标本浸泡于10%福尔马林组织固定液后一同送检,病理科医师进行石蜡包埋、切片、HE染色,在显微镜下观察黑染淋巴结和直肠浆肌层纳米炭标记显露状态(图4A、B)。

1.6 观察指标和评价标准

主要观察指标为术中直肠壁外侧纳米炭标记的显露情况、手术标本各区域测量(见上)和切缘阳性率,其他观察指标包括手术时间、术中出血量、淋巴结获得数、黑染淋巴结数和主要围手术期并发症(如吻合口漏、吻合口出血、术后感染、机械性肠梗阻)。

我们将术中纳米炭标记显露情况分为3种:①显露且标记效果良好,术中见纳米炭标记清晰显露在直肠固有筋膜表面,术后标本中纳米炭标记区宽度≤1.5 cm,可以辅助术者精准判断直肠远端离断缘;②显露但标记效果欠佳,术中见纳米炭标记显露在直肠固有筋膜表面,但黑染区宽度>1.5 cm,或纳米炭晕染至直肠固有筋膜以外的盆腔筋膜结构,起部分辅助手术作用;③显露失败,游离直肠时未见纳米炭标记显露,无辅助手术作用。

nCRT后肿瘤退缩分级(tumor regression grade,TRG)采用改良Ryan方案[7]:0级(完全退缩),镜下无可见的肿瘤细胞;1级(接近完全退缩),镜下仅见单个或小灶肿瘤细胞;2级(部分退缩),有明显退缩但残余肿瘤多于单个或小灶肿瘤细胞;3级(退缩不良或无退缩),残余肿瘤范围广泛,无明显退缩。

1.7 统计学方法

采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,不符合正态分布的计量资料用中位数(最小值～最大值)表示。计数资料用例(%)表示。

2 结果

46例均完成1周期新辅助放疗和2～6周期新辅助化疗。注射纳米炭至手术间隔时间105(77～182)d,nCRT结束至手术间隔时间45(33～119)d。顺利完成腹腔镜根治性直肠前切除术,经腹使用双吻合器技术行消化道重建。手术时间255(165～390)min,术中出血量90(50～450)ml,行末端回肠造口38例(82.6%)。术后主要并发症为吻合口漏8例,吻合口出血2例,术后感染6例(肺部感染3例,腹腔感染2例,切口感染1例),机械性肠梗阻3例,均经保守治疗痊愈。

2.1 nCRT后纳米炭标记显露情况

nCRT后复查肠镜时均可观察到直肠黏膜面纳米炭标记残迹(图1E～H)。

腹腔镜直肠前切除术中,41例(89.1%)可于游离直肠时观察到直肠外侧纳米炭标记显露(图2A、B),其中38例(82.6%)可以辅助术者精准判断手术远端切缘,符合“显露且标记效果良好”,3例(6.5%)纳米炭晕染范围较大,但仍可实现肿瘤原位切除,符合“显露但标记效果欠佳”。另外5例(10.9%)术中无法在腹腔镜下观察到纳米炭标记,判定为显露失败,术中借助肠镜观察黏膜面纳米炭残迹确定手术远端切缘。

2.2 标本测量

除16例难以分辨原发肿瘤区域无法完成测量者外,其余30例离体标本测量数据:切除肠管长度17.9(10.1～25.7)cm;原发肿瘤区域长径(4.3±0.8)cm;肿瘤退缩瘢痕直径2.5(0.8～4.8)cm;肿瘤下缘退缩长度1.0(0～2.9)cm。17例中位直肠癌远端切缘长度3.4(1.5～4.3)cm,13例低位直肠癌远端切缘长度1.6(0.5～2.8)cm。

2.3 术后病理

46例术中吻合口冰冻病理均为阴性,术后病理显示直肠标本远端切缘和环周切缘均为阴性。清扫淋巴结21(6～33)个,其中黑染淋巴结8(3～14)个,淋巴结黑染率为38%(18%～54%)(图4A)。

肿瘤退缩分级:0级15例(32.6%),1级13例(28.3%),2级10例(21.7%),3级8例(17.4%)。取直肠标本组织纳米炭区域进行HE染色后镜下观察,可见纳米炭颗粒渗透直肠壁全层,与直肠壁各层呈30°～45°,向周围弥散极少(图4B)。

3 讨论

nCRT可以使直肠癌达到减瘤的效果,降低肿瘤局部复发率,提高保肛率,是中低位LARC(Ⅱ、Ⅲ期)的标准治疗策略[8,9]。然而,LARC经nCRT后的安全手术远端切缘长度目前尚缺乏统一标准。Sun等[5]测量20例LARC新辅助放疗后手术标本肿瘤细胞向远端肠壁5、6、7点钟方向的扩散距离,最远壁内扩散距离分别为8.8 mm、7 mm和7 mm。Özer等[2]的研究显示,直肠癌nCRT后残留肿瘤细胞向远端壁内扩散的距离为(0.56±0.3)cm,其中87.9%的患者肿瘤壁内扩散距离<1 cm。似乎1 cm远端切缘标准仍然适用于nCRT后的直肠癌手术。但Hayden等[3]的研究显示nCRT后距离肿瘤瘢痕边缘3 cm范围内各个方向均可能存在碎片化的肿瘤细胞残留。对于nCRT后肿瘤呈碎片化退缩模式者,虽然肿瘤在密度上显著下降,肠黏膜趋向正常化,但肿瘤累及的范围较前可能并未缩小,呈大体肿瘤与镜下肿瘤退缩不同步现象[3]。研究表明,碎片化模式与较低的肿瘤降期率及较短的无病生存期有关,且存在较高的手术切缘阳性风险[10,11]。ASCRS建议[4],基于直肠癌nCRT前的初始分期,曾经肿瘤累及的区域均应切除,避免原位留下活癌细胞的可能。本研究结果显示,nCRT可使大体肿瘤下缘收缩1.0(0～2.9)cm,在肿瘤退缩区域离断肠管可能导致切缘阳性或零散的活癌细胞残留在远端肠壁。因此,对于nCRT后肿瘤退缩甚至达到cCR者,依据肿瘤瘢痕边缘确定的1 cm远端切缘是否充分仍然需要更多研究结果阐明。

nCRT使肠管和肿瘤收缩后,如何既做到原位切除又做到精准切除,避免浪费远端切缘,尽可能多地保留肛门直肠功能?在nCRT前对肿瘤下缘进行长期有效的标记可以很好地解决这个问题。现在临床上常用的示踪染料主要有3种:吲哚菁绿、印度墨水和纳米炭混悬注射液。吲哚菁绿近红外成像技术主要用于术中吻合口血运评估、早期肿瘤术中定位、淋巴结示踪等,而对于新辅助治疗后组织水肿或纤管样肠管渗透性较差[12],且其半衰期短,局部注射后的探测时间<10 d,不能满足新辅助治疗所需的时间跨度[13]。印度墨水虽然标记持续时间较长[14],但有引起局部溃疡、严重腹膜炎等不良反应的风险,安全性尚存在质疑[6]。纳米炭混悬液在肠道局部黏膜下注射后代谢缓慢,持续时间长,可持续6～12个月[6],可以满足术前完成2～5周期nCRT或6～8周期完全新辅助治疗(total neoadjuvant therapy,TNT)的时间需求,且鲜有文献报道纳米炭标记导致的并发症[6,15],本研究亦无纳米炭注射相关不良反应。因此,我们推荐在直肠癌nCRT前应用纳米炭标记技术,以长时间标记原发肿瘤区域下缘,解决后续手术中对远端切缘判断的盲目性。纳米炭标记时,应注意纳米炭的注射方法和剂量。我们在注射纳米炭前先注射玻璃酸钠盐水混合液,以减少纳米炭弥散。注射剂量应根据直肠系膜的厚度(参考MRI)适当增减,不可盲目追求染色效果而增加剂量,导致盆底晕染影响手术层面的判断。本研究5例纳米炭显露失败,考虑直肠系膜肥厚,纳米炭注射剂量较少以致未能渗透至直肠固有筋膜表面。

淋巴结获得数亦是直肠癌手术质量的一个重要评价标准。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)[16]和CSCO[8]结直肠癌诊疗指南均推荐直肠癌术后淋巴结检出总数不少于12枚。但nCRT后的直肠手术标本淋巴结检出难度增加。研究表明,通过纳米炭示踪部分肠管周围淋巴结可以增加直肠手术标本淋巴结检出数和微小淋巴结(直径≤5 mm)检出数[17],较吲哚菁绿示踪效果可能更具优势[18]。我们沿直肠固有筋膜游离直肠时,可以观察到黑染的淋巴结,有效辅助清扫位于直肠系膜边缘的淋巴结,防止残留。

鉴于直肠癌nCRT后达病理完全缓解(pathological complete remission,pCR)的高生存期,为追求高pCR率,出现各种组合的放化疗方案,新辅助治疗周期不断延长,新辅助治疗后cCR率有所增加,普遍在30%左右,术后pCR率达到10%～25%[19,20]。cCR通常指经新辅助治疗后,通过肛门指诊、内镜(活检)、肿瘤标志物、MRI及CT等检查,未发现直肠腔内残留肿瘤或全身远处转移[21]。pCR指直肠癌术后病理中未发现任何存活的肿瘤细胞[22]。目前研究表明,直肠内超声、MRI、CT和PET-CT等手段对nCRT后残留肿瘤的诊断能力均存在局限性,cCR与pCR的判断符合率仍不尽如人意[21,23],cCR手术切除后达pCR的比例仅为25%～30%,54%的pCR无法评估为cCR[24]。此外,cCR行“观察-等待”(watch-and-wait)策略者约25%在2年内局部复发[19,25]。因此,对于新辅助治疗后达cCR者,基于保直肠功能的“观察-等待”策略仅在国内少数中心试验性应用,行直肠癌根治术仍是第一选择。对于cCR,无论是行“观察-等待”策略后的随访检查,还是行根治术,纳米炭标记均可提供良好的定位作用[26]。

术后标本中原发肿瘤区域及原发肿瘤下缘退缩长度测量的经验:本研究30例手术标本剪开后可以辨认出原发肿瘤区域,稍隆起或凹陷,质地韧或与周围黏膜相似,伴少量黏膜纠集,而肿瘤瘢痕则呈火山口状,质地韧,覆少量白苔。另外16例手术标本无法分辨原发肿瘤区域,可能的原因有两点:第一,肿瘤生长类型为隆起型,瘤体虽较大,但根部向肠壁四周浸润较少,退缩模式以整块收缩为主。第二,新辅助治疗后与手术的间隔时间较长。nCRT导致肿块中大面积活癌细胞死亡,死亡细胞经过一段时间会被吸收,在此期间手术则标本中原发肿瘤区域和退缩瘢痕可同时存在,易于分辨[27],间隔时间过长则死亡细胞被吸收,退缩区修复为正常肠黏膜,则较难分辨出原发肿瘤区域。应注意的是,术后标本中原发肿瘤区域长径相较首次MRI测量的肿瘤长径偏小,可能与标本离体后少量收缩和放疗导致原发肿瘤下缘上移有关[5,28]。

综上所述,在nCRT前通过内镜对直肠癌远端进行纳米炭标记,可以长期稳定标记原发肿瘤下缘,辅助术者对缩小肿瘤的原发区域进行精准切除,值得推广应用。接下来,本课题组将对nCRT后肿瘤瘢痕边缘到纳米炭标记区域进行取材染色,探讨肿瘤黏膜下碎片化残留细胞与肿瘤瘢痕边缘的距离,为nCRT后腹腔镜直肠癌保肛手术安全切缘提供更多依据。