张 悦，郝 心，丁 宁，孙润权，赵 俊，赵亚莉，李易冉，李志刚＊＊

（1. 北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2. 中国中医科学院广安门医院 北京 100029；3. 北京中医药大学国际学院 北京 100029）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）也被称为“老年痴呆”，是一种以记忆障碍和失语、失认、失用为主要临床表现的神经退行性疾病[1]。AD 在全球死亡原因中排第五位，该病患病率和增长速度远超于其他疾病[2]。预计至21 世纪中叶，中国AD 患者将达2000 万，对个人生活以及社会支出造成巨大的负担[3-4]。随着人口老龄化进程的不断加快，AD 已成为亟待解决的公共卫生问题。

AD 的病理变化主要有淀粉样斑块沉积和神经原纤维缠结[1,5]。既往AD的研究机制主要有β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）级联假说，TAU 蛋白假说，线粒体自噬假说等。有越来越多的研究发现上述病理改变并不是导致认知功能下降的唯一原因[6-7]。血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）功能障碍贯穿AD 起病及发展的全过程[8]。血脑屏障的完整性由内皮细胞及其细胞间的紧密连接结构、基底膜、星形胶质细胞和周细胞等控制[9-10]。研究发现BBB 内皮功能和紧密连接结构改变引发炎症，累及海马神经元，并通过一系列级联反应加速AD 神经退行性改变[11-12]。影响BBB 功能障碍的原因有很多，如全身性的炎症、蛋白质金属酶（MMPs）、抗生素及自由基等[13-15]，其中BBB 的破坏与肠道菌群紊乱密切相关。研究发现无菌小鼠显示出BBB 通透性增加，而通透性的上升加剧了细菌异位到大脑产生神经炎症[16]。

从AD 的长期发展进程来看，肠道菌群紊乱是一个关键环节。肠道菌群能够释放大脑记忆活动所需的神经递质，维持大脑神经功能和中枢免疫系统密切相关[17]。研究发现缺乏肠道菌群的小鼠海马体积显著减小，恐惧焦虑反应显著增加，免疫功能低下[18]。这也证明了肠道菌群对机体发育以及神经功能的重要性。AD 发展初期已存在肠道菌群多样性减低和物种构成改变的情况，尤其以革兰氏阴性菌增加为病理特征。既往研究证实，对比健康人，AD 患者菌群构成表现出厚壁菌门丰度上升，拟杆菌门和双歧杆菌丰度下降[19]。这种菌群紊乱的情况同样也发生在AD 模型动物上，具体表现为变形菌门、大肠杆菌丰度显著上升，拟杆菌门丰度显著下降[20-21]。这类特征性的肠道菌群紊乱是AD 认知功能的下降的重要原因[22-24]。

肠道革兰氏阴性菌的致病分子是其细胞膜外膜组成成分-脂多糖（LPS）。AD患者和模型动物脑内LPS含量显著增多，这一病理改变和神经炎症显著相关。LPS是一种强效的促炎脂质分子，能够诱发肠道炎症、破坏肠上皮结构[25]、损伤肠黏膜屏障，致使大量LPS 和炎症物质进入外周诱发系统性炎症[26]。LPS本身作为大分子无法透过BBB，但一方面由于AD存在BBB功能障碍和肠道菌群紊乱，大大增加LPS侵入中枢的可能性；另一方面LPS及外周炎症反应能够破坏脑血管内皮结构，增加血脑屏障通透性[27-28]，随着血脑屏障通透性改变，LPS侵入中枢神经系统[29]，激活小胶质细胞，诱发一系列级联反应产生炎症诱导神经元的凋亡[30]。因此，血脑屏障的破坏是AD发病的一个重要环节，肠道菌群紊乱导致LPS增多可能是血脑屏障破坏的内在机制。

既往研究证实针刺能够改善AD 模型动物认知功能障碍[31-33]，还具有抗炎[34-35]、调节葡萄糖代谢[36]、调节脑血流量[37]等作用。但目前针刺调节AD 模型动物血脑屏障的内在机制尚不明确，因此本项研究选用6 月龄APP/PS1 小鼠作为动物模型，针刺“百会”、“印堂”、“足三里”，观察针刺对肠道菌群多样性及物种组成、血脑屏障紧密连接结构和LPS 的影响，旨在阐明针刺调节血脑屏障功能的肠道菌群机制，为针刺治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级6 月龄雄性APP/PS1 小鼠24 只和同背景C57BL/6 小鼠8 只，体质量（30±2）g；以上动物均购自卡文斯百格（苏州）模式动物研究有限公司，合格证：SCXK（苏）2018-0002。购入后于北京中医药大学屏障环境动物室饲养，于（23±1）℃，湿度45%，12 h光照，单笼饲养，自由进食水。由北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审核通过。

1.2 分组与干预

将APP/PS1小鼠随机分成模型组、针刺组、益生菌组，每组8只；同背景C57BL/6小鼠为对照组，8只。

针刺组采用自制鼠套固定，使用一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm），依据《实验动物针灸穴位图谱》在百会（GV20）、印堂（GV29）和足三里（ST36）上针刺20 min，百会、印堂横向穿刺深度2-3 mm，足三里直刺进针，深度为3 mm，术中每隔5 min 进行捻转，每次15 s。

益生菌组采用益生菌按8.7×108CFU·g-1·d-1进行灌胃。对照组和模型组不做任何干预，仅在其他组干预时，用鼠套束缚20 min，以上干预每天1 次，每周6次。连续45天。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂

益生菌（含两岐双歧杆菌Bb06、动物双歧杆菌BB-12、乳双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌R175、动物双歧杆菌B94、鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌LC11、瑞士乳杆菌R52、副干酪乳杆菌Lpc37、植物乳杆菌R1012、罗伊氏乳杆菌HA188、鼠李糖乳杆菌R11、嗜酸乳杆菌NCFM、嗜热链球菌St21，与菌共舞，ZHONG KE YI KANG，中国）、鼠源LPS 抗体（HycultBiotech，HM6011）、驴抗小鼠二抗（Abcam，ab150108）、DAPI 染液（Abcam、ab104139）。

1.3.2 仪器

一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm、北京中研泰和医药有限公司）、Morris水迷宫图像自动采集和分析系统（成都泰盟科技有限公司）、冰冻切片机（Leica、德国）、激光共聚焦显微镜（Leica、德国）石蜡切片机（Thermo Scientific，美国）。

1.4 Morris水迷宫检测

各组小鼠干预45 天后进行为期6 天的Morris 水迷宫行为学检测，检测装置包括一个圆形水池（直径90 cm、高50 cm、深30 cm），水池注水后加入奶粉，水温保持在（24±1）℃，圆柱形平台直径为9 cm、高28 cm。水桶上缘等距离设东、南、西、北4个标记点，4 个方向的池壁上分别悬挂不同形状、不同颜色的几何图形作为实验小鼠学习记忆的识别物。

1.4.1 隐蔽平台实验

平台位于第三象限的中央，在水面下1-2 cm，每只老鼠有60 s 的时间搜索隐藏的平台，如在60 s 内找到平台，则让其停留在平台上15 s，若未找到平台，引导其上平台停留15 s，每天训练2次，连续训练3天，记录逃避潜伏期。

1.4.2 空间探索实验

隐蔽平台实验结束后24 h，撤除平台，小鼠由原先平台象限对侧入水。每只动物进行1次空间探索实验，记录60 s内小鼠游泳轨迹，分析目标象限停留时间比及游泳路程百分比。

1.5 16s RNA检测

Morris 水迷宫检测结束后，收集各组小鼠肠道粪便样本，根据E.Z.N.A. soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）进行微生物群落总DNA 抽提，提取DNA 质量并测定其浓度和纯度；使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对16S rRNA 基因V3-V4 区进行PCR 扩增，随后回收PCR 产物，并对其进行纯化定量，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序，基于生物信息云isanger平台，进行生物信息学分析。

1.6 取材

干预结束后，各组小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，灌注针头插入左心室，剪开右心耳，0.9%生理盐水灌注约40 mL 至右心房流出清澈液体，肝脏变白，随后灌注4%多聚甲醛40 mL 后断头取脑。

1.7 免疫荧光观察脑内LPS表达情况

灌注后的脑组织于4%多聚甲醛4℃固定3 h，20%、30%蔗糖溶液梯度脱水，OCT 包埋，沿冠状面行冰冻切片，厚度为6 μm。切片添加驴血清室温封闭1 h，PBS 洗涤后加入一抗（LPS），4℃孵育过夜，PBS 洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，加入DAPI 染液，抗荧光淬灭封片剂封片，镜下待检。

1.8 透射电镜观察皮层微血管内皮结构

取皮层脑组织剪取多个1 mm3大小组织块，1%硝酸镧（LaNO3）漂洗液漂洗，3%戊二醛固定液4℃前固定过夜，1%锇酸-1% LaNO3后固定，系列乙醇、丙酮脱水，环氧树脂包埋，铜网行超薄切片，经铅染色，双氧铀酸复染，在透射电镜（HITACHI-7500）下观察脑微血管内皮紧密连接结构。

1.9 HE染色

将脑组织置于4%多聚甲醛中固定，随后进行石蜡包埋，在石蜡切片机下沿冠状面行4 μm 切片，切片烘烤后脱蜡，苏木素染色，盐酸乙醇分色，蒸馏水反蓝，乙醇梯度脱水，加入二甲苯，中性树脂封片。

1.10 统计学处理

使用SPSS软件26.0版（SPSS，The United States）进行统计分析，实验数据均以均值±标准差（±s）表示，Morris 水迷宫逃避潜伏期、各组游速均值采用重复测量的多因素方差分析，其余数据若符合正态分布并满足方差齐性时，采用单因素ANOVA 分析，LSD 检测法；对非正态分布的数据或方差不齐的数据，采用Kruskal-Wallis检验，以P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

2.1.1 逃避潜伏期

对照组、针刺组、益生菌组逃避潜伏期随时间的推移呈下降趋势，正常组逃避潜伏期下降趋势最快，针刺组逃避潜伏期下降趋势在2-3 天快于益生菌组，模型组无明显变化；模型组逃避潜伏期自3-5 天显著高于对照组（P<0.05），说明APP/PS1 小鼠存在空间学习和记忆能力障碍；较之模型组，针刺组和益生菌组自4-5 天逃避潜伏期显著下降（P<0.05），说明小鼠空间学习能力有显著提升。如表1所示。

表1 各组小鼠Morris水迷宫隐蔽平台实验逃避潜伏期比较（n=8）

2.1.2 目标象限游泳距离百分比

空间探索实验中模型组目标象限游泳距离百分比和时间比均显著低于对照组（P<0.05），说明APP/PS1小鼠记忆能力较差，较之模型组，针刺组和益生菌组目标象限游泳距离百分比显著升高（P<0.05），说明经针刺和益生菌的治疗后，小鼠的记忆能力有较大提升。如表2所示。

表2 各组小鼠Morris水迷宫空间探索实验时间比、路程比比较（n=8）

2.2 Shannon指数及门水平物种差异分析

α-多样性用来评估APP/PS1 小鼠肠道菌群多样性，在这里选用Shannon 指数作为参考，结果显示，模型组Shannon 指数显著低于对照组（P<0.05），说明模型组的物种多样性有显著下降；针刺组Shannon 指数显著高于模型组（P<0.05），物种多样性有显著上升；物种组成上，各组小鼠的物种组成主要以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门为主，通过比较各组变形菌门、拟杆菌门及厚壁菌门丰度，我们发现较之对照组，模型组变形菌门和厚壁菌门丰度显著升高（P<0.05），拟杆菌门丰度显著下降（P<0.05）；较之模型组，针刺组变形菌门和厚壁菌门丰度显著下降（P<0.05），拟杆菌门丰度显著上升（P<0.05）；此外，益生菌组变形菌门丰度显著低于模型组（P<0.05）。如表3所示。

表3 各组小鼠Shannon指数及门水平物种丰度比较（n=6）

2.3 海马内LPS含量

荧光显微镜下所示海马内LPS 为红色荧光，呈椭圆形，包围着神经元，对照组海马内未见LPS，模型组LPS 数量较多较密集，针刺组和益生菌组LPS 数量较少且较分散。如图1所示。

图1 各组小鼠脑内LPS表达情况（63×）

2.4 大脑皮层微血管内皮结构

透射电镜评估BBB 紧密连接结构的完整性。对照组血管内皮膜完整，连续，层次较清楚，紧密连接结构致密，基底膜完整未断裂；模型组可见内皮细胞紧密连接结构开放，基底膜断裂严重，边缘模糊不清，周围有细胞渗出，胞饮小泡增多；针刺组和益生菌组基底膜轮廓清晰完整，密度均匀，紧密连接结构有所改善。如图2所示。

图2 各组小鼠血管内皮紧密连接结构情况（11500×）

2.5 海马CA1区神经元表达情况

HE 染色显示对照组CA1 区神经元完整，排列紧密，无明显减少，细胞核清晰；模型组CA1 区神经元排列紊乱，一部分神经元变性坏死，细胞间距扩大，细胞核变性，固缩；针刺组和益生菌组CA1 区神经元排列及结构较之模型组有所改善。如图3所示。

图3 各组海马CA1区神经元表达情况（40×）

3 讨论

肠道菌群紊乱（菌种多样性的减低和菌种构成改变）是AD 重要的病理变化之一。研究发现6 月龄APP/PS1小鼠革兰氏阴性菌的丰度要显著高于野生正常小鼠（变形菌门、螺旋杆菌）空间认知能力已有显著下降[23]。所以本项研究选用APP/PS1 小鼠作为研究模型。16s RNA 高通量测序技术广泛运用于肠道微生物组学研究中。菌群检测结果显示出，较之对照组，模型组菌群多样性显著降低，变形菌门和厚壁菌门丰度显著上升，拟杆菌门丰度显著降低。Morris 水迷宫检测结果显示模型组空间认知和记忆能力显著下降。符合AD 认知功能下降和菌群变化的特征。既往许多证据表明益生菌能改善AD 认知功能障碍和调节肠道菌群[38-39]，因此我们设置益生菌组作为针刺组的阳性对照。结果显示出针刺组和益生菌组的认知功能较之模型组有显著改善，在对菌群的多样性和物种构成上也都显示出良性调节效应。

AD 模型动物肠道革兰氏阴性菌显著增加，大大增加了LPS 的暴露概率[40]，LPS 破坏血脑屏障，导致大脑稳态失衡激活免疫系统产生神经炎症反应[41]、诱导神经元凋亡、加速神经退行性改变。结合研究结果来看，模型组脑内LPS含量显著升高，透射电镜显示出血脑屏障紧密连接结构改变和基底膜的断裂，海马CA1区神经元结构排列紊乱，细胞核变性，表明AD 组存在血脑屏障破坏。针刺组和益生菌组皆能显著降低脑内LPS的水平，以及改善紧密连接结构和基底膜功能，推测针刺和益生菌对血脑屏障结构的调节可能是通过减低LPS水平来实现的。

中医认为AD 发病的基本病机是髓海不足、神机失用，病性属本虚标实，本为脾肾两虚，标为血瘀、痰浊、风火上扰神明[42]。针对以上病候特点，选用“百会”、“印堂”、“足三里”三穴。从经络理论来看，督脉为“阳脉之海”，其脉空虚无法上荣于脑，髓海不足，则头昏、眩晕、健忘。百会穴居“阳位”，能够调动一身之阳气，印堂穴镇惊醒神，两穴相配，能够起到醒脑开窍、祛风化痰、活血化瘀的治疗作用。足阳明胃经“循发迹，至额颅”，主治胃肠系统疾病和神志病。脾胃为后天之本，足三里穴通过健运中焦、补益气血、滋养脑窍以治本[43]。现代研究发现足三里还具有调节胃肠动力，平衡肠道菌群的作用[44]。三穴合治，反应了肠脑并调的治疗思路[45]。本项研究Morris 水迷宫检测结果显示针刺组对空间学习和记忆能力显著提升，显著提升肠道菌群多样性和改变物种构成，减少LPS负荷，调节BBB 紧密连接结构，表明针刺调节呈现出整体性和多靶点的作用特点。

后续仍需扩大样本量，丰富菌群检测手段来进一步阐明针刺调节AD 血脑屏障功能的肠道菌群机制。