木犀草素(3′,4′,5,7-四羟基黄酮,luteolin,LUT)属于天然黄酮类化合物,是临床治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的经典苗药追风伞、吉祥草、獐牙菜中的主要药效成分之一[1],其具有较好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、心脑血管保护、神经保护和调节血糖等作用[2-7]。研究表明,LUT在微摩尔浓度下即显示较强的抗炎活性,且课题组前期工作发现其可抑制RA中NLRP3炎性小体的表达,起到骨关节保护作用[8]。然而,LUT的水溶性差、半衰期短,经静脉及口服等方式给药后在关节腔内的浓度较低,很难达到有效治疗浓度。因此,需要长期重复给药,病人依从性差,极大地限制了其临床应用[9]。

经皮给药较其他给药途径,在治疗RA方面具有显著的疗效优势,如患者可自主在炎症部位给药,无肝首过效应,具有平稳的血-药浓度和持续的药物释放等,提高了患者的依从性。但由于皮肤角质层的屏障作用,使得大多数活性成分难以透过皮肤,从而影响了药效的发挥。因此,如何突破皮肤的角质层屏障作用是目前LUT经皮用于RA治疗亟待解决的问题。

微针是采用微米级尺寸的针头穿刺皮肤角质层的技术,具有疼痛感小、递送药物精准和给药方便等优势[10-11]。而采用水溶性高分子材料作为基质制备的可溶性微针(dissolvable microneedles,DMNs)克服了传统微针在载药方式和使用安全性等方面的缺陷,如固体微针存在给药剂量无法确定、针体断裂等安全风险。DMNs插入皮肤后可自行降解,且无残留物,从而提高了安全性[12-14]。然而,由于皮肤的弹性,DMNs针尖需要有足够的机械强度才能穿透角质层,背衬层则需要有足够的柔韧性与皮肤紧密贴合,以利于药物的成功递送。因此,选择合适的基质制备出具有合适机械强度的针尖与柔韧背衬的DMNs是一个关键的问题。当前,已有透明质酸(hyaluronic acid,HA)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚甲基乙烯基醚扁桃酸(gantrez S-97 BF)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)及丝素蛋白等多种材料被用于DMNs的制备[15-16]。Gantrez S-97 BF为脆性材料,制备出的微针针尖具有很强的机械强度,且安全性高。CS为糖胺聚糖类的天然来源生物活性大分子,生物相容性和生物降解性好,无毒副作用,且具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性,已用于骨关节炎的治疗[17]。

因此,针对LUT在治疗RA中存在的水溶性差、体内吸收低、半衰期短及目前LUT的给药系统对皮肤角质屏障的突破作用有限等问题,本研究采用脆性材料Gantrez S-97 BF和具有抗炎作用的CS作为基质,使用两步法制备具有合适机械强度及贴合性优良的LUT-DMNs经皮给药系统,并对LUT-DMNs进行了初步评价。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 Y29型聚二甲基硅氧烷(PDMS)阴模(针长570 μm,底部直径260 μm,针尖距离700 μm,350颗圆形排布,直径17.5 mm,台州微芯医药科技有限公司);TD5M低速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司);CX40P偏光显微镜(宁波舜宇仪器有限公司);SU8010型扫描电子显微镜(日本日立公司);1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);SQP型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.2 药品与试剂 木犀草素对照品(含量:94.4%,批号:111520-202006,中国食品药品检定研究院);木犀草素原料药(纯度96.0%,批号:C29J8Y38884,上海源叶生物科技有限公司);硫酸软骨素(批号:9007-28-7,凯米克化工有限公司);聚甲基乙烯基醚扁桃酸(批号:0002389247,Ashland公司);聚乙烯吡咯烷酮K-90(批号:C181110102,西安天正有限公司);聚乙烯醇(批号:20201001,无锡市亚泰联合化工有限公司);亚甲基蓝(批号:20180310,天津市致远化学试剂有限公司);甲醇为色谱纯,制剂用水为纯化水,高效液相色谱用水为超纯水。

2 结果

2.1 LUT-DMNs处方及制备工艺考察

2.1.1 LUT-DMNs的制备 本实验采用金属微针模具制备PDMS阴模,采用两步浇筑法制备可溶性微针。将基质材料分散至纯水中,静置24 h使其充分溶胀。称取一定量含药基质倒入模具中,4 000 r/min离心20 min,将离心管旋转180°,再次离心20 min。倒入背衬基质溶液,于干燥器中室温条件下干燥24 h后,用镊子小心脱模,即得LUT-DMNs贴片。

2.1.2 针尖基质材料的筛选 CS为脆性高分子材料,故选择羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP K-30)、透明质酸(HA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和Gantrez S-97 BF等常见的5种韧性高分子材料与其联合使用。以微针阵列完整性、气泡量及针尖硬度作为评价指标,筛选出适合的LUT微针基质材料。

结果如图1所示,以CS联合CMC-Na制得的微针贴片完整性较差,且机械强度不足;CS联合PVP K-30制得的微针贴片完整性较好,但贴片韧性较差,容易碎裂,且贴片背衬不平整;CS联合HA制得的微针贴片完整性较差,且难以干燥完全;CS联合HPMC无法获得成型的微针贴片;CS联合Gantrez S-97 BF制得的微针贴片完整性好,背衬平整,无气泡,且机械强度良好,表明由CS联合Gantrez S-97 BF制备出的可溶性微针贴片在以上所有组合中性能最佳。因此,在后续试验中选择CS与Gantrez S-97 BF作为微针的针尖基质材料。

A:CS+CMC-Na;B:CS+PVP K-30;C:CS+HA;D:CS+Gantrez S-97 BF。

2.1.3 针尖基质比例考察 采用CS与Gantrez S-97 BF为针尖基质材料,分别以CS:Gantrenz S-97质量比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,基质材料与纯水的比例为1∶2,按2.1.1项下方法制备空白DMNs,以干燥脱模后DMNs有无气泡、体积有无明显缩小、针尖完整度及机械强度为指标,考察针尖混合基质材料的比例。

结果如图2所示,因基质溶液黏度随CS用量的增加而减小(CS∶Gantrez S-97 BF = 9∶1),干燥后所得的DMNs贴片体积明显缩小,贴片中含有较多气泡,贴片颜色加深,且机械强度下降。当Gantrez S-97 BF的占比较大时(CS∶Gantrez S-97 BF =1∶9),基质溶液黏度过大,不易浇筑。而当CS∶Gantrez S-97 BF为2∶8、3∶7、4∶6时,基质溶液黏度适中,易于浇筑,干燥后所得DMNs贴片体积变化较小,贴片中气泡产生较少。其中,当CS∶Gantrez S-97 BF比例为2∶8时,所制得的贴片外观形态最佳,机械强度最优。因此,选择CS∶Gantrez S-97 BF为2∶8作为针尖基质材料。

A:1∶9;B:2∶8;C:3∶7;D:4∶6;E:5∶5;F:6∶4;G:7∶3;H:8∶2;I:9∶1。

2.1.4 针尖基质材料与纯水比例考察 采用2.1.3项下所筛选出的基质材料比例,分别以基质材料∶纯水为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,按2.1.1项下方法制备空白DMNs,以干燥脱模后DMNs贴片有无气泡、体积变化程度、针体完整度及机械强度为指标,考察针尖基质材料与纯水比例。

当基质材料与纯水的比例为1∶1时,因溶剂量过少,基质材料无法充分溶胀于水中,基质液过于黏稠,导致无法成功浇筑。随着纯水比例的增加,针尖基质材料溶液流动性增强,但DMNs贴片干燥后体积缩小程度随着纯水比例的增大而增加,且脱模时贴片质脆易碎。当基质材料与纯水比例为1∶2、1∶4时,微针贴片中存在颗粒物,可能为部分基质材料析出,外观形态较差。而当基质材料与纯水比例为1∶3时,针尖基质材料溶液黏度适中,干燥后所得贴片体积变化较小,且脱模时不易碎裂(图3)。因此,选择1∶3作为DMNs处方中针尖基质材料与纯水的比例。

A:1∶2;B:1∶3;C:1∶4。

2.1.5 针尖基质材料溶液与LUT乙醇溶液比例考察 采用2.1.4项下所筛选出的针尖基质材料与纯水比例,称取10.0 mg的LUT,并将其加入到5 mL的95%乙醇中,超声溶解,得到2.0 mg/mL的LUT乙醇溶液。分别以针尖基质材料溶液∶LUT乙醇溶液为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2,按2.1.1项下方法制备LUT-DMNs,以所得针尖基质材料溶液黏度是否易于浇筑,干燥脱模后体积变化程度,针尖完整度及机械强度为指标,考察针尖基质材料溶液与LUT乙醇溶液的比例。

当针尖基质材料与LUT乙醇溶液比例为1∶1、1∶2、1∶3时,脱模时极易碎裂,无法完整脱模,不能形成完整微针。当基质材料与LUT乙醇溶液比例为2∶1、2∶3、3∶2时,所得贴片中存在颗粒物,可能为基质材料或LUT析出,外观形态不佳。当针尖基质材料溶液与LUT乙醇溶液比例为3∶1时,干燥后所得的LUT-DMNs贴片外观形态良好,体积变化小,易于脱模,机械强度良好(图4)。因此,选择3∶1作为LUT-DMNs处方中针尖基质材料溶液与LUT乙醇溶液的比例。

A:2∶1;B:2∶3;C:3∶2;D:3∶1。

2.1.6 针尖干燥条件考察 将LUT-DMNs置于(25±1) ℃条件下干燥器中干燥24 h或(40±1) ℃烘箱中干燥10 h,以干燥后所得LUT-DMNs的成型性为指标,考察针尖的干燥条件。

结果如图5所示,烘箱干燥所得LUT-DMNs贴片气泡较多,表面不平整。而在室温(25±1) ℃条件下于干燥器中干燥所得微针贴片无气泡,外观形态良好。因此,选择室温(25±1) ℃条件下于干燥器中干燥24 h作为LUT-DMNs的干燥方式。

A:烘箱(40±1) ℃干燥10 h;B:干燥器(25±1) ℃干燥24 h。

2.1.7 LUT-DMNs背衬基质考察 分别选取15% PVA、30% PVA、15% PVP K-90、30% PVP K-90、HPMC(10%)+Gantrenz S-97(2.5%)作为背衬基质材料,按2.1.1项下方法制备LUT-DMNs,以干燥脱模后LUT-DMNs贴片中气泡、韧性、含针量以及干燥时间为指标,考察背衬基质材料的种类和用量。

结果如图6所示,以15% PVP K-90或30% PVP K-90 作为背衬层时,所需干燥时间较其他组延长了2～4 h,干燥时间较长。以HPMC(10%)+Gantrez S-97 BF(2.5%)作为背衬层时,干燥后韧性差,LUT-DMNs贴片无法弯曲,不能贴合皮肤。30% PVA溶液则过于黏稠,难以浇筑。而以15% PVA作为背衬层时,干燥后韧性较其他组好,能够较大程度弯曲,易于贴合皮肤。因此,选用15% PVA作为LUT-DMNs的背衬材料。

A:HPMC(10%)+Gantrez S-97 BF(2.5%);B:15% PVA;C:15% PVP K-90;D:30% PVP K-90。

2.2 LUT-DMNs的表征

2.2.1 LUT-DMNs的形貌表征 将按2.1.1项下方法制得的LUT-DMNs贴片分别置于光学显微镜与扫描电子显微镜下,观察LUT-DMNs的立体形状、针长、含针量及针尖断裂等情况。

结果如图7所示,所制得的LUT-DMNs针形良好,含针量高,背衬具有较好的韧性,弯曲时不易开裂。光学显微镜与扫描电子显微镜下发现,微针针体为圆锥体,表面光滑,针体长度约为500 μm,表明所得LUT-DMNs形貌良好。

A:贴片外观;B:贴片弯曲情况;C:光学显微镜形态;D:扫描电子显微镜形态。

2.2.2 LUT-DMNs机械性能考察 取LUT-DMNs贴片置于物性分析仪样品基座上,将LUT-DMNs针尖朝上,使针的方向与探头的轴向平行,选取合适的模式和参数,测量随着探头位移过程中LUT-DMNs针尖所受到的应力,并绘制压变曲线。

结果如图8所示,空白微针与载药微针的针尖在压缩至0.2 mm时,应力均大于1.5 N,具备刺穿皮肤角质层所需应力,载药后的微针与空白微针的机械性能相似,表明所制备的LUT-DMNs具有良好的机械性能。

A:空白微针贴片;B:载药微针贴片。

2.2.3 LUT-DMNs皮肤穿刺性能考察 将LUT-DMNs贴片针尖朝向已去除脂肪的裸鼠离体皮肤角质层侧,以适当力度按压3 min后,移去贴片,立即用亚甲基蓝试剂染色,保留1 min后用脱脂棉蘸取异丙醇擦去角质层表面染料,观察被染色的孔道并拍照。

结果如图9所示,皮肤表面的蓝点清晰可见,呈规律排列,且与微针阵列的排列一致,表明制备的LUT-DMNs具备穿刺皮肤角质层的机械强度,具有优良的皮肤穿刺性能。

图9 LUT-DMNs应用于离体裸鼠皮肤后染色结果

2.2.4 LUT-DMNs溶解性能考察 将LUT-DMNs贴片针尖朝向保鲜膜,以适当力度按压1 min后,置于盛有适量纯水的烧杯上,于(37±1) ℃水浴锅中加热,模拟LUT-DMNs作用于皮肤上的水合作用,并于0、5、10、30、60、120 min取出,于显微镜下观察针尖溶解状况,并拍照记录。

LUT-DMNs的溶解性能如图10所示,结果显示,微针在10 min内溶解较为缓慢,针尖溶解不明显;30 min时溶解加快,在2 h时仅有部分针体残留,几乎溶解完全。

A:0 min;B:5 min;C:10 min;D:30 min;E:60 min;F:120 min。

2.2.5 DMNs作用于皮肤后皮肤愈合情况考察 取空白DMNs贴片,以适当力度按压于裸鼠背部皮肤,30 s后取下,并采用摄像记录皮肤愈合情况。结果如图11所示,取下LUT-DMNs贴片后,在3 min时部分孔道逐渐闭合,在10 min时孔道已完全消失,无红肿等现象,皮肤愈合状况良好。

A:取下贴片后0 min;B:取下贴片后3 min;C:取下贴片后10 min。

2.3 LUT-DMNs载药量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取LUT对照品适量,加甲醇溶液溶解并制成59.29 μg/mL的LUT对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取LUT-DMNs 1片,用解剖刀将针尖与底座分离,将针尖用200 μL去离子水溶胀,加甲醇超声提取并定容至2 mL,用0.45 μm滤膜过滤,收集续滤液,即得。

2.3.3 色谱条件 Platisil C18色谱柱(250×4.6 mm,5 μm),流动相甲醇-0.4%磷酸水溶液(60∶40),流速1.0 min/mL,检测波长350 nm,柱温35 ℃,进样量5 μL。

2.3.4 专属性 分别取空白甲醇、空白DMNs供试品、LUT对照品及LUT-DMNs样品溶液,按照上述色谱条件进样。结果显示,LUT的出峰时间约为11 min,微针基质无干扰,表明该方法专属性良好(图12)。

A:空白甲醇;B:空白DMNs供试品;C:LUT对照品;D:LUT-DMNs样品。

2.3.5 标准曲线的建立 分别精密吸取适量对照品溶液于量瓶中,加甲醇制成质量浓度为0.46、0.92、1.84、7.41、14.82、29.64、59.29 μg/mL的系列对照品溶液。按照上述色谱条件测定,以LUT质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程y=42.802x-3.257 3(r=1.000 0),表面LUT在0.46～59.29 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.6 精密度考察 取浓度为0.92、7.41、29.64 μg/mL的LUT对照品溶液,按上述色谱条件分别连续进样6次,计算得LUT峰面积的RSD分别为1.43%、1.08%、0.29%,表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性考察 取LUT-DMNs 1片,按2.3.2项下方法处理,在上述色谱条件下分别于0、2、4、8、12、48 h进样分析,计算得LUT峰面积在48 h内的RSD为1.15%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 取LUT-DMNs 6片,照2.3.2项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,结果平均每片微针针尖含LUT 25.35 μg,重复性的RSD为1.63%,表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率考察 取已知含量的LUT-DMNs 6片,各自切取一半的针尖,分别加入LUT对照品12.65 μg,照2.3.2项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,结果平均加样回收率102.97 %,RSD(%)为1.13%,表明加样回收率符合要求(表1)。

2.3.10样品测定 取3批LUT-DMNs,每批3片,按2.3.2项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,结果3批LUT-DMNs的载药量为(25.66±0.25) μg/片。

3 讨论

LUT属于天然四羟基黄酮化合物,具有消炎、抗过敏、抗菌、抗病毒等多种药理活性。CS作为基质材料之一,生物相容性和生物降解性好,无毒副作用,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性[18-20],已用于骨关节炎的治疗[21]。临床上胸腺肽肠溶片联合复方硫酸软骨素片治疗类风湿性关节炎获得较好的治疗效果[22],将其用于DMNs的制备可起到药-辅合一的作用。

本研究采用物理交联法将CS与Gantrez S-97 BF混合作为LUT-DMNs的针尖材料,将聚乙烯醇(PVA)作为背衬材料,以利用新型经皮给药系统来改善LUT难以透过皮肤角质层屏障的问题。本研究考察了不同比例下的基质材料、基质水溶液、基质水-含药溶液、背衬材料浓度以及干燥条件对LUT-DMNs的影响,结果显示,针尖基质比例为CS∶Gantrez S-97 BF(2∶8),基质材料与水溶液比例为1∶3,基质水溶液与LUT醇溶液比例为3∶1,以及干燥条件为室温下干燥器中干燥24 h时所得到的LUT-DMNs针体机械性能良好,具备穿刺皮肤角质层的能力,能够在一定时间内溶解,以达到经皮递送药物的目的,且移除后创口恢复迅速,不易感染;背衬材料为15% PVA时具有较好的韧性,以便于给药时贴合皮肤。本研究制备的木犀草素可溶性微针拥有良好的外观、形貌和机械性能,具有一定的药物缓释功能,皮肤贴合性好,去除后皮肤孔道能够快速愈合,可实现LUT的成功载药,为今后的制剂开发和医学应用奠定了实验基础。