孙静 谢淑娜 李保叶 钱蕾 茹艳艳 刘桂珍 郝俊杰

关键词：玉米穗腐病；拟轮枝镰孢；接种体

由拟轮枝镰孢侵染引起的玉米穗腐病是玉米生产上普遍发生的一种真菌病害，该病害不但造成玉米的产量损失，还会产生多种真菌毒素，严重危害粮饲安全及人畜健康。玉米镰孢穗腐病属于气传病害，虽可通过种子、土壤传播，但其病原菌主要是借助空气传播，通过花丝通道或虫鸟等造成的创伤口侵染玉米籽粒。

玉米为高大密植作物，穗腐病发病籽粒通常被苞叶包裹，一般在玉米生长中后期才能被发现，故穗腐病具有隐蔽性和防治难的特点，目前尚无对该病害防治效果较好的化学药剂或生物制剂，选育和推广抗病品种依然是防控该病害最经济有效的措施。抗病品种的选育成效取决于抗源的挖掘、抗病种质的创制等多个方面，这些均需进行抗病性的表型鉴定和评价，而抗性表型鉴定的一个重要环节就是病害的人工接种。

我国现行农业行业标准推荐的玉米镰孢穗腐病人工接种方法有2种，一种是花丝通道接种法，即经玉米花丝通道注射镰孢菌分生孢子悬浮液进行接种，另一种是籽粒伤口接种法，即用粗大金属针刺穿玉米苞叶注入分生孢子悬浮液接种，或用带菌牙签穿透苞叶插入穗部接种，上述两种方法的接种体为镰孢菌分生孢子悬浮液或长有菌丝的牙签，其培养制备均需超净工作台、培养箱等专业仪器设备以及经验丰富的技术人员，且制备过程繁琐，耗时较长。目前，育种工作者具有对自交系或杂交组合等进行穗腐病人工接种鉴定的需求，但大批量育种材料的鉴定需要制备大量接种体，占用大量时间及人力物力，加之我国部分玉米种业企业或育种团队并不完全具备相应仪器设备和技术条件，接种体的制备往往限制了穗腐病人工接种鉴定，仅能依靠自然发病进行筛选鉴定。

针对玉米穗腐病优势病原菌——拟轮枝镰孢，利用其在病穗上可产生大量分生孢子的特性，本团队研发了一种制备拟轮枝镰孢分生孢子悬浮液接种体（下文简称“接种体”）的简易方法。为验证该简易方法制备的接种体接种效果能否达到常规制备接种体的水平，本研究将简易制备的不同浓度接种体、-18℃不同冻存时长接种体分别与常规制备接种体进行田间穗腐病接种效果的比较，筛选简易制备接种体的合适接种浓度，观察冻存时长对简易制备接种体接种效果的影响，并将简易制备接种体试用于玉米品种的田间穗腐病抗性鉴定，以明确简易制备接种体在田间穗腐病抗性鉴定工作中的实际应用价值。

1材料与方法

1.1接种体的制备

1.1.1病穗或病粒的收集保存

在玉米收获季，从田间收集由拟轮枝镰孢侵染引起穗腐病典型症状的病穗，挑选籽粒表面仅有白色至粉白色绒状霉层、未见其他污染菌的病穗或病粒，晾干至籽粒含水量不高于14%，于室内通风干燥处常温贮存供第二年使用。

1.1.2接种体的简易制备

从上述保存的病穗上剥下病粒，称取10g，加入无菌水500～800mL（条件受限时可用市售纯净水、矿泉水或凉白开），戴无菌手套（条件受限时可用干净的乳胶手套，或洗净双手裸手操作）反复搓洗玉米病粒约10～15min，将病粒表面着生的分生孢子洗脱，洗脱液用干净的双层纱布过滤除去杂质，滤液加入无菌水至10L，获得的分生孢子悬浮液中孢子含量约为1×105～5×105个/mL（此为多次试配所得的经验值，如条件允许建议检测孢子含量），即为简易制备接种体。

1.1.3常规方法制备接种体

供试菌株拟轮枝镰孢单孢菌株MR1195，为2019年从田间采集的穗腐病病粒上分离纯化所得，在PDA平板上26℃培养3～4d，挑取菌落边缘的新鲜菌丝块（约2～3mm见方）5～10块，放入200mL CMC液体培养基中，180r/min、24℃振荡培养3～4d，双层无菌纱布过滤除去杂质，获得的分生孢子悬浮液于光学显微镜下用血球计数板测定浓度，再用适量无菌水将分生孢子悬浮液中的孢子含量调至1×106个/mL，即为常规制备接种体。

1.1.4不同浓度接种体的简易制备

称取一定重量的拟轮枝镰孢病粒（表1），按1.1.2方法加水、洗脱、过滤后再加水至相应的体积（表1），制备成4种不同浓度的接种体，孢子含量分别为1×10s～5×105个/mL（TAI）、1×106～5×106个/mL（TA2）、1×107～5×107个/mL（TA3）和1×108～5×108个/mL（TA4）。以常规方法制备的接种体（1×106个/mL）（TCK）和无菌水（TO）分别作为对照，共设置6个处理比较筛选田间接种的合适浓度（表1）。

1.1.5不同冻存时长接种体的简易制备

按1.1.2方法简易制备接种体（孢子含量1×10s～5×105个/mL），分别在距离接种日期0d（接种当日现配现用，未冻存）及前7、15、30、50d設置不同冻存时长处理和对照（表2），比较冻存时长对接种效果的影响。冻存的接种体在使用前约16h取出，室温自然化冻。

1.2田间试验

1.2.1田间试验设计

田间试验于2020年至2022年在河南省新乡市平原示范区河南现代农业研究开发基地（116°24＇E，39°54＇N）进行。不同浓度接种体比较试验（试验A）于2020年进行，在玉米吐丝散粉期，使用简易制备的不同浓度接种体接种玉米品种‘郑单958’（中抗镰孢穗腐病）和‘硕育173’（感镰孢穗腐病），以常规制备接种体和无菌水接种作为对照，共6个处理（表1）。不同冷冻时长接种体比较试验（试验B）于2021年进行，供试品种及对照同试验A，共7个处理（表2）。玉米品种的拟轮枝镰孢穗腐病田间抗性鉴定试验（试验C）于2022年进行，供试品种为2022年从市场上或育种工作者处收集的33个玉米品种，抗病对照为自交系‘X178’，感病对照为自交系‘掖478’（表3）。

试验A、B于试验当年6月10日前后播种，试验C于2022年6月17日播种。所有试验均为行长6m，行距0.6m，每行留苗约25株，单行区，各处理或品种随机排列，3次重复，常规田间管理。

1.2.2接种方法

玉米穗腐病的田间接种参考现行的农业行业标准，采用花丝通道注射法接种：在玉米吐丝散粉后3～5d，使用连续可调注射器，将接种体从雌穗顶端斜上方处沿花丝通道注入苞叶和穗轴之间，让接种体沿花丝向内渗流。每株玉米只在上部第一个雌穗定量注入2mL接种体。由于各品种生育期不一致，接种通常分批次进行。

1.2.3田间调查及抗性评价

接种后50d左右，在玉米收获前调查。去除接种穗苞叶后，按照1、3、5、7、9级的分级标准逐穗调查，具体分级调查和抗性评价方法参考玉米镰孢穗腐病抗病虫性鉴定技术规范。计算每个接种处理单次重复中所有被调查穗的平均病情级别，并依据平均病级进行抗性评价。

1.3数据统计分析

数据统计分析在SAS9.2软件中进行，方差分析使用ANOVA程序，多重比较采用最小显著差异法（Least Significant Difference， LSD法）。

2结果与分析

2.1不同浓度接种体的接种效果比较

对2020年试验A的调查结果表明，所有接种处理的穗腐平均病级（4.3～7.8）均显著高于无菌水接种的空白对照TO（抗、感品种上分别为2.4、2.5）（P<0.05，图1），说明自然发病不影响本年度穗腐病的接种鉴定，本批次接种有效。在中抗品种‘郑单958’上，处理TA4（1×108～5×108个/mL）的平均病级为5.9，TA3（1×107～5×107个/mL）的平均病级为5.8，均显著高于常规制备接种体接种对照TCK（1×106个/mL）的平均病级4.3（P<0. 05）；处理TA2（1×106～5×106个/mL）、TAI（1×105～5×105个/mL）的平均病级分别为5.3、5.1，与TCK的平均病级4.3之间差异不显著（P>0.05）（图1）。在感病品种‘硕育173’上，处理TA4的平均病级为7.8，显著高于TCK的平均病级6.4（P<0. 05），处理TA3、TA2、TAI的平均病级分别为7.4、7.4、7．0，与TCK的平均病级6.4之间差异不显著（P>0.05）（图1）。4种不同浓度的简易制备接种体接种后的平均病级在抗、感品种上虽表现出了随接种体孢子液浓度升高而升高的趋势，但同一品种上各浓度处理间的差异均不显著（P>0.05，图1）。

以上结果说明，简易制备接种体在孢子液浓度为1×105～5×105个/mL时，接种后的效果即可达到常规制备接种体（1×106个/mL）的水平。

2.2不同冻存时长接种体的接种效果比较

对2021年试验B的调查结果表明，抗、感品种上均为处理TBI（简易制备接种体冻存Od后接种）的平均病级（6.0、8.1）最高，处理TB5（简易制备接种体冻存50d后接种）的平均病级（4.1、4.2）最低，整体表现出接种体冻存时间越久、接种后的平均病级就越低的趋势（图2）。在中抗品种‘郑单958’上，处理TB1、TB2、TB3（简易制备接种体冻存0、7、15d后接种）的平均病级分别为6.0、5.5、4.5，处理间差异均不显著（P>0.05），与对照TCK（常规制备接种体现配现用接种）的平均病级4.5之间差异也不显著（P>0.05）；处理TB4、TB5（简易制备接种体冻存30、50 d后接种）的平均病级分别为4.3、4.1，显著低于处理TB1的平均病级6．0（P<0.05），与对照TCK（4.5）之间差异不显著（P>0.05），但显著高于无菌水接种的空白对照T0 （2.3）（P<0.05）（图2）。在感病品种‘硕育173’上，处理TB1、TB2的平均病级分别为8.1、7.3，处理间差异不显著（P>0.05）；处理TB2、TB3的平均病级7.3、6.5，均与对照TCK的平均病级6.5之间差异不显著（P>0.05），但三者均显著高于处理TB4（5.2）和TB5（4.2）（P<0.05）；处理TB4（5.2）与TB5 （4.2）之间差异不显著（P>0.05），二者均显著高于空白对照T0（2.3）（P<0.05）（图2）。

以上结果说明，简易制备接种体在-18℃冻存后再用于接种，接种后的平均病级会随冻存时间的延长而下降，但冻存时长在7d时的接种效果仍与简易制备接种体现配现用相当；冻存时长在15d时，接种效果与常规制备接种体现配现用相当。简易制备接种体冻存时长超过30d时，接种后的平均病级在感病品种上显著降低。

2.3田间应用

对2022年试验C的调查结果表明，对照品种‘XI178’的平均病级为2.3，鉴定结果为抗病（R），‘掖478’的平均病级为7.6，鉴定结果为高感（HS），表明本批次抗性鉴定结果有效。参试的已知抗性品种中，‘郑单958’的平均病級为4.9，‘硕育173’的平均病级为6.7，分别鉴定为中抗（MR）和感病（S），均符合品种自身抗性水平。33个受试玉米品种中，对拟轮枝镰孢穗腐病表现为高感（HS）的有1个，占全部品种的3.0%；表现为感病（S）的有20个，占60.6%；表现为中抗（MR）的有11个，占33.3%；表现为抗病（R）的有1个，占3.0%；没有表现为高抗（HR）的品种（表3）。抗性鉴定结果表明，33个受试品种中对拟轮枝镰孢穗腐病表现为中抗及以上的品种较少（12个，36.4%>，多数品种表现为感病或高感（21个，63.6%）。

3结论与讨论

近年来，玉米穗腐病抗病品种的选育备受重视，国家农作物品种审定委员会在国家级玉米品种审定标准（2021年修订）中，也将玉米穗腐病新增为一票否决病害：高感即淘汰。这就要求育种工作者在选育玉米品种时更加注意品种对穗腐病的抗性表现，而通过人工接种来鉴定玉米种质材料对穗腐病的抗性是培育抗病品种中不可或缺的重要环节。玉米穗腐病的人工接种通常采用花丝通道接种法和籽粒伤口接种法，这2种方法都可以使用病原菌分生孢子悬浮液作为接种体。本文介绍了1种制备拟轮枝镰孢分生孢子悬浮液接种体的简易方法，该方法不受仪器设备及操作技术限制，简单易操作、成本低、效率高。

将接种体的常规制备法与简易制备法进行了比较（表4），常规制备法在制备过程中需要超净工作台、培养箱、恒温摇床、显微镜等多种仪器设备及精细的无菌操作，经菌株培养、摇培扩繁、过滤、镜检、调浓度等一系列流程，通常6～8d才能完成一批接种体的制备，步骤多、时间长，期间若操作不当易导致接种体污染，且一次制备体积受摇床容量限制。简易制备法则只需称取一定量的病粒，经兑水洗脱、过滤加水即完成接种体制备，步骤少、操作容易、效率高，10g病粒一次即可制备出10L接种体（表1），能够在短时间内简单、快速、大量制备拟轮枝镰孢穗腐病接种体，满足大批量材料抗性鉴定的需求，方便实用，具有较好的经济效益和推广价值。

应用本研究简易制备法的重要前提是收集到较纯的拟轮枝镰孢病粒作为制备原料，避免使用带有杂菌的病粒。玉米穗腐病的病原种类繁多，被拟轮枝镰孢侵染的玉米籽粒表面多出现白色至粉白色的绒状霉层，区别于禾谷镰孢、木霉、曲霉、青霉等其他病原菌侵染形成以紫红色、绿色、黄绿色、灰褐色、炭黑色、灰绿色等为主的霉层。田间环境复杂，有些自然发病的拟轮枝镰孢病穗也会被其他真菌侵染，若将其作为制备原料可能会造成接种后的病穗被杂菌污染。为了更方便地获取本方法所需的原料病粒，基于我们的实践经验，一是推荐使用常规制备接种体人工接种拟轮枝镰孢所得的典型病穗，二是推荐从感病品种如‘豫单606’‘硕育173’上收集拟轮枝镰孢病穗，这些品种通常自然发病较重，杂菌污染较少；从上述两类病穗中挑选使用被拟轮枝镰孢白色或粉白色霉层覆盖且未见其他杂菌的病粒，即使病粒上仍带有少量难以发现的杂菌，制备出的接种体接种后发病也会以拟轮枝镰孢穗腐为主，少量杂菌污染不影响穗腐病鉴定结果（图3）。

在拟轮枝镰孢穗腐病田间接种研究中，通常使用的接种体孢子液浓度多为1×106～5×106个／mL。本研究中使用簡易制备法制备的接种体在孢子液浓度为1×10s～5×105个/mL时，接种效果即可达到常规制备接种体（1×106个/mL）接种后的水平（图3），且继续提高简易制备接种体的浓度并不能使平均病级显著提高（图1），故推荐在使用简易制备法制备接种体时，采用孢子液浓度1×105～5×105个/mL即可。

玉米镰孢穗腐病的人工接种时期一般为玉米吐丝授粉后7d内，但不同玉米材料的生育期并不完全一致，故接种常需分批次进行。采用简易制备法一次制备大量接种体能够保证分批次接种中孢子液浓度的一致性，暂时不用的接种体则可冷冻保存备用。低温冷冻通过降低细胞的代谢活性来保持真菌的稳定，可以较好地保持病原真菌的活力和致病性，但-18℃下冻存时间的长短对拟轮枝镰孢分生孢子活性、致病力等有何影响尚未见报道。本研究比较了简易制备接种体在家用冰箱可达到的-18℃下冻存不同时长后的接种效果，结果表明接种体冻存15d时接种效果仍可达到常规制备接种体现用现配的水平，而冻存30d以上的接种体接种后在感病品种上的平均病级显著降低（图2），可能导致难以用接种结果区分抗、感品种，故不推荐使用冻存30d以上的简易制备接种体进行接种鉴定。

2022年在使用简易制备接种体接种鉴定33个玉米品种对拟轮枝镰孢穗腐病抗性的田间试验中，抗病对照自交系‘X178’、感病对照自交系‘掖478’和已知抗性的品种如‘郑单958’‘硕育173’等的抗性表现均较稳定且符合预期，鉴定结果可信，说明用简易制备法制备的接种体在田间接种中表现良好，可用于玉米品种或育种材料的抗性鉴定及筛选。在本研究测试的参试品种中，表现为中抗以上的品种仅占36.4%，可见目前常用的多数品种仍缺乏对镰孢穗腐病的抗性，加强玉米抗性种质资源的收集和鉴定、筛选高抗材料对于穗腐病抗性育种及玉米穗腐病的防控、增产提质非常重要。本文提出的接种体简易制备法通过降低技术及设备限制、简化制备流程拓宽了接种体制备技术的应用范畴，可以让育种工作者和育种企业更加简便快捷地完成大批量穗腐病抗性种质资源的人工接种鉴定和筛选。简易制备法的不足在于制备原料所用病粒中的拟轮枝镰孢通常难以达到实验室纯培养菌株的纯度，接种后常会存在少量杂菌污染的现象（图3a），在对少量材料进行穗腐病抗性精准鉴定时，建议仍选用常规制备法制备高纯度接种体。根据需鉴定材料数量及鉴定目的合理选用两种接种体制备方法，将会使穗腐病的人工接种鉴定更加高效而准确。