张俊蕾 盖晓彤 赵正婷 刘弟 陈敏 姜宁 刘雅婷

关键词：南美红辣椒脉斑驳病毒；反转录一环介导等温扩增；灵敏度；检测

南美红辣椒脉斑驳病毒（chilli veinal mottle vi-rus，ChiVMV）属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属Potyviruts，其基因组由一条正单链RNA组成，全长约9700bp。ChiVMV主要依靠各种蚜虫以非持久性方式传播。1979年在马来半岛的辣椒上首次发现了南美红辣椒脉斑驳病毒；2017年印度辣椒种植地区感染ChiVMV最严重地块的感病率高达41.82%；我国于2003年首次在陕西省的辣椒上发现ChiVMV；随后2010年在云南省大理市巍山县的烟田里发现烟株受ChiVMV侵害，主要症状为褪绿黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷；2014年报道称ChiVMV在四川烟株上的侵染率达到3%左右；2022年在贵州的烟叶上检测到ChiVMV。病毒检测是监测、预报、防控病毒病的重要环节。目前检测ChiVMV的方法主要有电子显微镜技术、免疫血清学技术、指示植物检测技术以及分子生物学技术等，但是这些检测方法因技术复杂、费时费力、成本高等原因难以在基层田间推广，因此建立一种简单、快速、灵敏、高效检测ChiVMV的技术尤为重要。2000年日本学者Notomi等发明的环介导等温扩增技术（loop-media-ted isothermal amplification，LAMP）是分子生物学研究领域中一种极为重要的手段，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用DNA链置换聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件（65～90℃）保温几十分钟完成核酸扩增反应，通过荧光染色等方法在数分钟内即可观察结果。但LAMP检测方法只针对DNA模板，为实现用该方法以RNA模板进行扩增，在LAMP反应体系中加入反转录酶，可在某等温条件下一步进行RNA逆转录和核酸扩增，即为反转录一环介导等温扩增技术（re-verse transcription， loop-mediated isothermal am-plification，RT-LAMP）。近年来，RT-LAMP已被广泛应用于动植物病毒检测，与传统的检测方法相比，该技术成本低、灵敏度极高、操作简单、不需要昂贵的仪器和分析手段，适用于田间基层进行病毒检测。目前还未见利用RT-LAMP技术检测ChiVMV的相关报道，本研究旨在建立一种简便、快捷、灵敏的ChiVMV检测方法。

1材料和方法

1.1材料

本试验所用的ChiVMV、马铃薯Y病毒（potatovirus Y，PVY）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic vi-rus，TMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic vlrus，CMV）、番茄褐色皱纹果病毒（tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV）、番茄环纹斑点病毒（tomatozonate spot virus，TZSV）、烟草脉带花叶病毒（to-bacco vein banding mosaic virus，TVBMV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）、朱顶红褪绿环斑病毒（hippeastrum chlorotic ringspot vi-rus，HCRV）的阳性烟叶样品由本课题组纯化和保存。

1.2方法

1.2.1引物设计

依据GenBank中登录的云南地区ChiVMV分离物基因组（GenBank序列登录号：MT974520）衣壳蛋白（capsid protein，CP）基因的保守区域，利用Primer Explorer 5.0（http：∥primerexplorer. jp/e/）设计5组引物（表1），每组包含F3/B3（外引物）、FIP/BIP（内引物）和LF/LB（环引物），引物由成都生物公司合成。

1.2.2RNA的提取

采用TRNzoI Universal总RNA提取试剂盒（北京天根公司）提取病毒总RNA，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，若出现3条明亮条带证明所提取RNA质量较好，提取的RNA保存于-800C冰箱备用。

1.2.5引物筛选

采用设计的5组引物（表1），以ChiVMV阳性的烟叶总RNA为模板进行扩增，体系参考WarmStart通用LAMP/RT-LAMP 2×预混液（含UDG）（美国NewEngland Biolabs公司）说明书：WarmStart LAMP2×Mix 12.5uL，F3/B3（10mmol/L）各0.5uL，FIP/BIP （10mmol/L）各4uL， LF/LB （10 mmol/L）各1uL，RNA（1ug）2uL，加Nuclease-free H90补足至25uL。65℃恒温扩增60min，每组引物均以健康烟叶RNA为模板的阴性对照，试验重复3次，最终筛选出1组特异性强的引物。

1.2.6RT-LAIV[P檢测体系优化

以ChiVMV阳性的烟叶总RNA为模板，采用单一变量法对反应温度（59、61、63、65、67、69℃）、反应时间（30、40、50、60、70、80 min）、反应体系中Mg2+浓度（2、4、6、8、10、12mmol/L，其中RT-LAMP基本反应体系内2.5uL 10×ThermopolBuffer中含有2 mmol/L Mg2+）、dNTPs浓度（0，0.2、0.6、1．0、1.4、1.8、2.2 mmol/L）、甜菜碱浓度（0、0.6、0.8、1．0、1.2、1.4、1.6 mmol/l．）和内外引物浓度比（1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1）进行优化。所有单因素优化试验中均以健康烟草RNA作为阴性对照，优化某一因素时其他因子参照RT-LAMP基本体系。反应结束后，反应产物中加入0.5uL的1000×SYBR Green工荧光染料（北京索莱宝科技有限公司）进行可视化检测，随后取5uL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。试验重复3次。

1.2.7RT-LAMP体系的验证

RT-LAMP反应结果的判定方法：1）电泳检测。取5uL反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪（上海天能）内观察到条带呈现梯状，则为阳性。2）荧光检测。25uL RT-LAMP扩增产物中加入0.5uL1000×SYBR Green I荧光染料后，阳性样品内荧光染料为荧光绿色，阴性为橙黄色]。

2结果与分析

2.1最佳条件的筛选与优化

2.1.1引物筛选

本研究设计了5组引物，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图la）显示，引物组CH-CP-3～CH-CP-5均能扩增出条带，但引物CH-CP-5出现假阳性，而引物组CH-CP-3的扩增产物形成的梯状电泳条带比其他引物更清晰、明亮且无假阳性；将荧光染色剂加入反应产物中，染色结果与电泳结果一致（图1b），没有扩增条带的产物为橙黄色，有扩增条带的产物则为绿色，将其置于紫外灯下观察，没有条带的产物不能发出白色荧光，而有条带的产物可以发出白色荧光，表明引物组CH-CP-3的特异性最强，故选用CH-CP-3作为该体系的引物。

2.1.2反应温度优化

利用筛选出的引物组CH-CP-3，在RT-LAMP基本体系的基础上对反应温度进行优化，结果表明，采用CH-CP-3引物组，在63、65、67、69℃4个温度下产物均产生梯状电泳条带（图2a），同时荧光检测结果与电泳检测结果一致（图2b），即这4个反应温度结果均呈现绿色，且在紫外灯下显白色荧光。但63℃（泳道4）时扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮，且基于实际应用选择最佳扩增反应温度为63℃。

2.1.3反应时间优化

利用筛选出的引物组CH-CP-3，反应体系采用RT-LAMP基本体系，反应温度设为63℃，对反应时间进行优化，结果表明，在6个时间下产物均形成梯状电泳条带（图3a），荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图3b），有梯状条带的呈现绿色，且在紫外灯下显白色荧光。在50min条件下扩增产物形成的梯状电泳条带比30、40min更清晰明亮，且与60～80min相差不大（图3a），为节省试验时间，最佳反应时间选择50min。

2.1.4甜菜碱浓度优化

基于上述优化反应体系对甜菜碱浓度（0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L）进行优化，结果表明，7个浓度下均能扩增出条带，但在1.0～1.4mmol/L之间的3个浓度条件下，扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图4a）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图4b），有梯状条带的都呈现绿色，在紫外灯下显白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择甜菜碱的最适反应浓度为1.0mmol/L。

2.1.5dNTPs浓度优化

基于上述优化的反应体系对dNTPs反应浓度（0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/L）进行优化，结果表明，dNTPs浓度在0.2～1.8mmol/L下均能扩增出条带，且5个浓度扩增产物形成的梯状电泳条带亮度均相差不大（图5a）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图5b），有梯状条带的呈现绿色，且在紫外灯下显白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择的最适反应dNTPs浓度为0.2mmol/L。

2.1.6Mg2+浓度优化

基于上述优化反应体系，在2～12mmol/L之间以2mmol/L为梯度设置6个Mg2+浓度进行优化。结果表明2～8mmol/L浓度下均能扩增出条带，但在4mmol/L条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图6a）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图6b），有梯状条带的都呈现绿色，且在紫外灯下显白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择最适Mg2+浓度为4mmol/L。

2.1.7内外引物浓度比优化

基于上述优化反应体系，设置8个内外引物比梯度1：1～8：1，以筛选出最适的内外引物浓度比。结果表明，8个内外引物浓度比均能扩增出条带，但在4：1条件下扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图7a）；其荧光结果与凝胶电泳检测结果一致（图7b），有梯状条带的都呈现绿色，且在紫外灯下显白色荧光。结合实际应用，选择最适内外引物浓度比为4：1。

2.2RT-LAMP灵敏度试验

将507.4ng/uL的总RNA进行10倍梯度的连续稀释获得9个浓度，各取1uL作为模板分别采用优化的RT-LAMP及RT-PCR检测方法进行扩增。结果表明，RT-LAMP的检测灵敏度可达到5.07×10-s ng/uL（图8a，b），而RT-PCR仅可达到5.07×10-3ng/uL（图8c），可见RT-LAMP的灵敏度是普通RT-PCR的100倍。

2.3RT-LAMP特异性试验

以分别含有ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV及PVY病毒的烟叶总RNA为模板，利用优化的RT-LAMP检测体系进行扩增。凝胶电泳结果表明，只能在携带ChiVMV的烟叶样品中扩增出条带，其他样品中无扩增条带（图9a）；其荧光结果与凝胶电泳结果一致，仅携带ChiVMV的样品显绿色，且在紫外灯下显白色荧光（图9b）。表明建立的ChiVMV RT-LAMP检测体系具有很好的特异性。

3结论与讨论

目前利用RT-LAMP进行检测的应用较多，如植物病毒检测方面，2010年Liu等运用该技术检测了RNA病毒烟草花叶病毒；2020年高彦萍等建立了马铃薯卷叶病毒的RT-LAMP检测技术。在细菌检测方面，2012年黄丽等建立了柑橘黄龙病的RT-LAMP检测方法。此外，2018年张吉红等建立了转基因油菜‘Ms8’品系的LAMP检测体系等。

本研究根据ChiVMV的CP序列，设置了5组RT-LAMP引物，从中筛选出最佳引物组CH-CP-3，随后采用单因素试验探究了反应温度、反应时间，甜菜碱、dNTPs、Mg2+浓度和内外引物浓度比等反应条件及组分对RT-LAMP体系的影响。结果显示，反应时间，dNTPs、Mg2+浓度和内外引物浓度比对RT-LAMP体系的影响比较明显；甜菜碱浓度的影响比较小。在25uL反应体系中各组分最佳加入量分别为：补足至25uL。最佳反应条件为63℃50min，且其灵敏度是RT-PCR的100倍。由此可见，与RT-PCR相比，RT-LAMP具有用时短、反应温度低、灵敏度高的特点，应用前景广阔。

RT-LAMP技术采用6条引物进行扩增，灵敏度极强，但也极易产生假阳性。产生假阳性的主要原因是该检测技术扩增时拷贝系数高，能检测到空气中存在的阳性气溶胶粒子。因此本研究在总结前人经验的基础上，在操作过程中采取“一步一环境”的措施，即在体系加样、RNA模板加样、荧光染色剂加样、凝胶电泳等操作流程时均在不同的操作间，并在加完RNA模板后用石蜡油封层，以减少气溶胶污染的可能性。此外，RT-LAMP需要6条引物，加之其拷贝系数高，导致其对引物具有高要求．因此当引物设计不恰当时也极容易产生假阳性现象，故本研究在引物筛选时对每条引物均设阴性对照，以防产生假阳性现象而影响后续试验。本研究建立并优化了烤烟上南美红辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV） RT-LAMP检测技术，并采用了RT-PCR和荧光检测方法对优化的检测方法进行平行比对验证，二者检测结果一致，说明本研究建立的ChiVMVRT-LAMP检测技术具有可靠性。除此之外，RT-LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果）且灵敏度是RT-PCR的100倍，較RT-PCR操作简易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要，具有广阔的应用前景。