李诗 程有普 潘兴鲁 董丰收 吴小虎 徐军 郑永权

关键词：农药残留；溴虫氟苯双酰胺；辣椒；代谢物；消解动态

辣椒原产于中南美洲的热带和亚热带地区，具有种植范围广、消费量大、加工方式多、消费功能多、种植风险小的特点。据统计，近年来我国辣椒种植面积稳定在3亿hm2以上。2015年辣椒的种植面积超过大白菜、番茄、普通白菜，位居全国蔬菜种植面积的第一位；2021年我国辣椒的种植面积突破3.4亿hm2，占全球辣椒种植面积的40%。蓟马、粉虱、蚜虫、螨类是辣椒生产上的主要害虫，严重影响了辣椒的品质和产量，导致种植户的经济收入降低。溴虫氟苯双酰胺（broflanilide）是由巴斯夫和三井化学联合开发的一类高效、广谱、作用机制新颖的新型双酰胺类杀虫剂，在昆虫中能够产生两种结构相似的代谢物，即DM-8007和S（PFP-OH）-8007（图1）。溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物的结构相似，都具有较高的lgP（某物质在正辛醇和水中的分配系数比值的对数值），因此容易在植物或动物的脂质中累积，其中DM-8007的杀虫活性高于母体。Casida等的研究表明，溴虫氟苯双酰胺是一种GABA门控氯离子通道变构调节剂，其通过作用于氯离子通道的一个独特位点，抑制氯离子向细胞内传递，导致昆虫痉挛，从而表现出快速杀虫活性。溴虫氟苯双酰胺对蓟马、粉虱、蚜虫和螨类都具有良好的杀虫活性，对于防治辣椒虫害具有很大的潜能。

目前，关于溴虫氟苯双酰胺的研究主要集中在杀虫活性和作用机理方面。溴虫氟苯双酰胺对斑马鱼Danio rerzo的急性毒性较低，但可能诱发慢性毒性；其对斑马鱼的胚胎和心脏发育、大脑、神经递质、相关的鱼类行为都有影响。关于溴虫氟苯双酰胺及其代谢物在农产品中的农药残留检测的报道较少，An等首次报道了溴虫氟苯双酰胺及其两种代謝物在5种土壤中的残留检测方法；Xie等报道了溴虫氟苯双酰胺在水稻及其相关环境中的残留分析及消解动态；贺敏等报道了溴虫氟苯双酰胺在番茄和甘蓝中的残留检测方法。但溴虫氟苯双酰胺及其代谢物在辣椒上的残留检测方法及消解动态的研究尚属空白，制约了溴虫氟苯双酰胺在辣椒种植体系的科学应用和相关残留限量标准的制定。

本研究运用改良的QuEChERS法结合超高效液相色谱串联质谱，建立了一种快速、简便、灵敏、高效、安全的方法，用于辣椒中溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物残留的定量和定性分析，同时利用该方法研究了5%溴虫氟苯双酰胺悬浮剂在湖南、河南、浙江3个地点辣椒中的残留消解动态。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（Exion-LC UHPLC， SCIEX TRIPLE QUAD 4500），美国AB SCIEX公司；KQ500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；F2102微型组织粉碎机，天津泰斯特公司；CK-1000组织振荡混合仪，北京托摩根生物有限公司；TG16-WS型台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；XW-80A型漩涡混合器，美国Scientific Industries公司；Filter Unit型0.22um有机滤膜，Agela Technologies公司。

溴虫氟苯双酰胺标准品（99.67%）、S（PFP-OH）-8007标准品（99.02%）、DM-8007 （99.86%）标准品，北京勤诚亦信科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯），北京北化精细化学品有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA，40um）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18，40um）和石墨化炭黑（GCB，40um），天津博纳艾杰尔科技有限公司；AgilentZORBAX EclipsePlus C18色谱柱（50mm×2.1mm．1.7um），天津博纳艾杰尔科技有限公司；乙腈、无水MgS04、NaCI（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2田间试验设计

本研究在湖南、河南、浙江3个地点开展5%溴虫氟苯双酰胺悬浮剂在辣椒上的残留消解试验，设置对照小区和处理小区，每个小区面积50m2。采用兑水喷雾的方式进行施药，5%溴虫氟苯双酰胺悬浮剂制剂用量为30mL/667m2（有效成分用量22.5g/hm2），用水量为50L/667m2，施药2次，施药间隔7d，对照小区施等量清水。于最后1次施药后的2h、1、3、5、7d采集辣椒样品。将采集的辣椒样本去除其果梗及萼片后切成1cm左右小块混匀，袋装保存，每份200g，储存于-18℃冷库。

1.3样品提取与净化

称取10.0g（精确到0.01g）均质辣椒样品于含50mL聚四氟乙烯的离心管中，加入10mL乙腈，振荡提取10min，再加入1gNaCI和4g无水MgS04，振荡5min，4000r/min离心5min，然后将1.5mL上清液转移至装有150mg无水MgS04、50mg PSA和10mg GCB的2mL离心管中，2500r/min涡旋3min，8000r/min离心5min，上清液过0.22um有机滤膜，储存于-20℃。

1.4超高效液相色谱一串联质谱条件

1.4.1液相色谱条件

色谱条件：Agilent ZORBAX EclipsePlus C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7gm）。柱温为40℃，进样体积为3uL，流动相A为0.2%（V/V）甲酸水，流动相B为甲醇，流速为0.3mL/min。梯度洗脱程序见表1所示。

1.4.2质谱条件

电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式；碰撞气：氮气；气帘气（curtain gas，CUR）：10psi;喷撞气（collision gas，CAD）：9psi；离子化电压：5000V;离子源温度：500℃；喷雾气（nebulizer gas，GSI）：60psi；辅助加热气（heating gas，GS2）：60psi；采集方式：多反应监测模式（MMR），碰撞室入口电压（entrance potential，EP）：10V；碰撞室出口电压（collision cell exit potential，CXP）：6V，质谱参数见表2。

1.5标准曲线的绘制、基质效应评价及添加回收试验

准确称取一定量的溴虫氟苯双酰胺（纯度99. 67%），DM-8007（纯度99.02%）和S（PFP-OH）-8007（纯度99.86%）标准品，分别用乙腈溶剂配制成10mL1000mg/L标准储备液，4℃保存。而后将3种标准储备液等比例混合后用乙腈或空白基质提取液连续梯度稀释，配制成0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的溶剂标准溶液和基质标准溶液，按照1.4节中的检测条件进行测定，绘制一个横坐标为溴虫氟苯双酰胺及其代谢物的质量浓度（mg/L），纵坐标为定量离子对的峰面积的工作曲线。

本试验采用辣椒空白基质中添加待测物的方法评价基质效应（matrix effects，Me），通过基质标准曲线和溶剂标准曲线斜率的比值进行判断。当-20%+50%时，基质效应高，对定量影响干扰较大。

在本研究中，以溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物在辣椒样品中的添加回收率和相对标准偏差评价该方法的准确度和精密度，以符合准确度和精密度要求的最小添加浓度为定量限（LOQ）。由于溴虫氟苯双酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007尚未制定相关最大残留量（MRL），因此设置辣椒中溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物3个添加水平分别为0. 01mg/kg（LOQ）、0.10mg/kg （10×LOQ）、0.50mg/kg（50×LOQ），按照1.3节中的方法提取、净化，按照1.4节中的仪器条件检测，根据进样结果计算添加回收率及相对标准偏差（RSD）。根据农药残留试验准则要求，当添加水平为0.01～0.1mg/kg时，回收率需为70%～120%，RSD需小于或等于20%;当添加水平为0.1～1mg/kg时，回收率需为70%～110%，RSD需小于或等于10%。

2結果与分析

2.1样品提取剂与净化剂的选择和优化

本研究对比了乙腈与1%甲酸乙腈作为提取剂时的回收率，同时考虑到辣椒中辣椒素、辣椒红素以及色素的含量较高，对50mg PSA、50mg C18、50mgPSA+10mg GCB、50mg C18+10mg GCB、50mgPSA+50mg C18、50mg PSA+50mg C18+10mgGCB（以上均加入150mg无水MgS04）6种净化剂的净化效果进行了对比。结果（图2）显示，以乙腈或1%甲酸乙腈作为提取剂时溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物的回收率均在70%～120%，满足《农作物中农药残留试验准则》（NY/T788-2018）。同时，由于大量、连续地使用有机酸可能会腐蚀仪器、造成损害，因此在保证回收率的前提下，从仪器保护的角度选择乙腈作为溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物的提取剂；在使用乙腈作为提取剂，50mg PSA+10mg GCB作为净化剂时，溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物的回收率及色素去除效果最佳。这主要是由于PSA具有极性和弱阴离子交换功能，可以有效去除一些有机酚类、脂肪酸等极性或弱酸性物质，而GCB主要吸附色素和一些具有平面环状结构的物质。因此最终选择150mg无水MgS04+50mg PSA+10mgGCB作为净化剂对提取液进行净化。

2.2方法验证

2.2.1线性关系

用乙腈和辣椒空白基质提取液配制溶剂标准溶液和基质标准溶液，按照1.4节中的检测条件，对0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的系列标准溶液进行检测分析，根据溴虫氟苯双酰胺及其代谢物的质量浓度（mg/L）和定量离子对的峰面积拟合线性方程。如表3所示，在0.01～1mg/L范围内，溴虫氟苯双酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007在乙腈和辣椒空白基质溶液中质量浓度与相应定量离子对的峰面积间线性关系良好，相关系数均大于0.9947。

2.2.2基质效应

如表3所示，溴虫氟苯双酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007在辣椒中的基质效应分别为12.3%、16.4%和53.7%，说明S（PFP-OH）-8007在辣椒中存在较强的基质效应，不能忽略。因此，为了弥补基质效应对结果的影响，本研究采用基质标准曲线对实际样品进行定量分析，以提高方法的准确性和通用性。

2.2.3方法的准确性、精密度和灵敏度

本研究在空白辣椒样品提取液中添加0.01、0.1、0.5mg/kg 3个不同水平的3种混合目标化合物，每个加标水平设置5个重复。结果（表4）表明，溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物在3个加标水平下的回收率范围为90.8%～97.4%，RSD为1.3%～5.7%，LOQ均为0.01mg/kg，均满足农药残留分析的要求。

2.3实际样品测定

用建立的方法对采集的辣椒样品进行了检测，溴虫氟苯双酰胺在辣椒样品中的残留消解动态符合一级动力学方程，溴虫氟苯双酰胺在湖南、河南和浙江的消解曲线（图3）分别为y=0.042 3e-0.097（R2=0.9124）、y=0.128 le-0.146（R2=0.9085）和y=0.266 le-0.248（R2=0.9772），消解半衰期分别为7.7、4.7d和2.8d：DM-8007和S（PFP-OH）-8007在湖南、河南和浙江3个采样地点中均未检出。溴虫氟苯双酰胺及其代谢物色谱图见图4。

3结论与讨论

本研究建立并优化了基于超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）同时测定辣椒中溴虫氟苯双酰胺及其代谢物DM-8007、和S（PFP-OH）-8007的残留分析方法，并对湖南、河南、浙江3个地点施用5%溴虫氟苯双酰胺悬浮剂后的辣椒样品进行残留检测。样品经过乙腈提取，以150mg MgS04、50mg PSA及10mg GCB净化；结果表明，该方法的准确性、精密度和灵敏度均满足残留分析方法的要求；检测了5%溴虫氟苯双酰胺悬浮剂在湖南、河南、浙江3个地点的消解动态，溴虫氟苯双酰胺在辣椒样品中消解动态规律符合一级反应动力学方程，在3个地点的半衰期分别为7.7、4.7d和2.8d；本研究为溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物在辣椒样品中的残留分析提供了一种快速、准确的方法，为溴虫氟苯双酰胺及其两种代谢物在其他样品中的残留分析提供了参考。