高飞 兰华林 黄杰 胡泽斌★ 周海卫★

脊髓小脑共济失调Ⅲ型（Spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）属于常染色体显性遗传病，临床也称为马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease，MJD）［1］，患者临床表现为共济失调、逐步丧失行走能力且并发严重的吞咽困难。该病主要的致病基因为atxn3 基因，该基因位于常染色体14q32.12，全长48 240 bp，包含11 个外显子，atxn3基因上的CAG 重复序列位于其10 号外显子内［2］。atxn3基因编码AT3（ataxin3）蛋白，AT3 蛋白是可以普遍表达的一种去泛化酶，其通过蛋白降解途径直接参与调控泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）。此外，该蛋白还可作用于转录调控因子，在转录调控的过程中发挥重要作用。SCA3 在世界许多地区是最常见的脊髓小脑性共济失调病。在我国，该病占全部脊髓小脑性共济失调患者的48%～73%［3］。SCA3 在不同人群中发病率差异较大，平均在5.0/10 万人［4］。CAG 三核苷酸重复拷贝数在代间传递过程中扩增会出现子代发病年龄提前和病情加重的现象［5］。同时，由于SCA3 存在高度临床异质性，患儿出生后SCA3 表型的严重程度无法准确估量。目前唯一有效确诊SCA3 患者的途径就是进行基因筛查。国家参考品的研制可对国内SCA3 疾病的基因检测试剂盒进行方法学评价，以确保其各项性能指标的准确、为临床诊断提供更为有力的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

核酸提取采用凯杰企业管理（上海）有限公司的DNA 纯 化/1取1剂盒（QIAamp DNA Mini Kit）；实验用荧光定量PCR 仪的型号为ABI7500、PCR -毛细管电泳仪型号分别为ABI3500、ABI3500xl 和ABI3730XL，均由美国Thermo Fisher Scientific Inc 公司生产；实验用PCR 仪型号为BIO-RAD C1000，由美国伯乐生命医学产品（上海）有限公司生产。脊髓小脑共济失调Ⅲ型参考品研制所需的细胞系包含的基因型别：4 个异常型（CAG 重复45～87）及4 个野生型（正常人的样本，CAG 重复12～44），均购自中南大学医学遗传学重点实验室；2 个非人源的阴性参考品所需原料为采集非人源病原体感染的细胞；本次参考品协作标定实验所使用的试剂盒购自：深圳泰乐德医疗有限公司、厦门百欧迅生物科技有限公司、北京阅微基因技术股份有限公司、广州达瑞生物科技有限公司和中南大学遗传学实验室。

1.2 方法

1.2.1 原料的制备

采用含有柠檬酸钠的单次采血管收集50 mL的新鲜外周血样本，冷链（2℃～8℃）运输至无菌实验室。使用聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque，F-H）密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），然后加入EB 病毒及细胞培养液，进行细胞的永生化转化培养，在细胞浓度达到2×105个/mL 时，进行核酸提取，同时分别采用荧光定量PCR 仪测定核酸浓度、分光光度仪测定核酸质量。

1.2.2 国家参考品的原料验证

分别使用荧光定量仪和分光光度仪对国家参考品所包含的4 份突变样本、4 份野生型样本及2份非人源型样本进行核酸浓度和质量的检测，然后使用基因分析仪对样本进行atxn3基因检测。

1.2.3 国家参考品的制备

将参考品盘包含的10 份样本基因组DNA 的浓度稀释至50 ng/μL，无菌操作分装于灭菌冻存管内，每管分装0.5 mL，分装后的参考品放置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2.4 国家参考品的协作标定

通过报名的方式筛选了5 家生产atxn3基因检测产品的企业和相关科研机构对制备完成的国家参考品样本进行实验。5 家单位的检测方法包括：实时荧光定量PCR 法（fluorescent quantitative realtime PCR，FQ-PCR）、PCR-毛细管电泳法等。验证的性能指标包含：①阳性符合率：检测各自试剂盒检测性能指标内的atxn3基因不同型别的4 个阳性参考品，符合率100%为达标；②阴性符合率：检测各自试剂盒检测性能指标内的6 份阴性样本（4 个野生型阴性参考品及2 个非人源样本），符合率100%为达标；③最低检出限：在各自试剂盒规定的最低检出限的浓度范围内检测全部10 个样本，其中阳性样本均应检出，阴性样本均应不检出。

1.2.5 国家参考品的稳定性与均匀性验证

国家参考品需进行冻融稳定性的验证。将1 套国家参考品反复冻融3 次后，采用深圳泰乐德医疗有限公司提供的atxn3基因CAG 重复检测试剂盒（荧光PCR 毛细管电泳法）进行冻融稳定性的检测，线性相关系数应＞0.990 0。同时，随机抽取3 套国家参考品，采用深圳泰乐德医疗有限公司提供的atxn3基因CAG 重复检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）进行均匀性检测验证，线性相关系数应＞0.990 0。

2 结果

2.1 国家参考品原料验证结果

全部阳性样本及4 种野生型样本的碱基排列与样本的CAG 重复数一致且核酸质量合格。检测的结果见图1、表1、2。

表1 atxn3 基因浓度及核酸质量Table 1 atxn3 gene concentration and nucleic acid quality

表2 atxn3 基因分析结果Table 2 Results of atxn3 gene analysis

图1 参考品毛细管电泳结果Figure 1 Reference sample capillary electrophoresis results

2.2 不同单位对参考品的协作标定结果

5 家atxn3基因检测试剂盒生产及科研单位各自采用自行生产的试剂盒对国家参考品进行了协作标定的实验，结果表明参考品的实验结果符合规定。见表3。

2.3 参考品的稳定性和均匀性验证结果

稳定性实验结果显示，三次冻融的线性相关系数为0.999 9，说明反复冻融对参考品的稳定性没有影响。均匀性实验结果显示，3 套国家参考品均匀性线性相关系数为1.000 0，均匀性符合规定。验证结果见图2、3、表4。

表4 参考品盘3 次冻融和均一性检测结果Table 4 3 freeze-thaw test results of reference plate

图3 3 次均匀性检测结果Figure 3 Three uniformity testing results

3 讨论

欧洲分子基因诊断质量联盟分别于2010 年和2019 年出台了《脊髓小脑共济失调分子遗传学检测最佳实践指南》和《常染色体隐性小脑共济失调分类指导原则》。指南建议开展此类疾病基因检测的临床实验室和试剂盒研发机构均应建立适合自己实验室的参考品（盘），从而保证各单位在进行atxn3基因检测时能准确地判读型别。目前，该疾病在我国以成人发病居多［6］，发病类型除进展性脑病和自主神经病等典型表现外，还包括阿尔兹海默病和帕金森综合征等多种临床表型，导致临床诊断困难。国内外多篇论文都已报道SCA3 的致病基因和相关基因检测方法，且atxn3基因的CAG 重复长度与该疾病的相关性已经明确［7］。因此，参考品的研制既可评价基因检测试剂盒的性能指标［8］，又可提升临床诊断的准确率。

本研究通过5 家单位的试验平台对国家参考品进行协作标定。各单位均选择了PCR 与毛细管电泳仪相结合的标准方法，但平台有所区别，其中，A、B、C 单位选择采用ABI7500 荧光定量PCR 仪结合ABI3500 毛细管电泳仪的方法、D 单位选择采用Veriti PCR 仪结合3730XL 毛细管电泳仪的方法、E 单位选择采用BIO-RAD C1000PCR 仪结合ABI3500xl 毛细管电泳仪的方法，上述单位均采用各自研发的试剂盒对国家参考品包含的10 个atxn3基因突变型和野生型样本的CAG重复数和最低检测限进行检测，结果均一致，说明采用不同平台及不同试剂盒检测国家参考品的结果具有一致性。目前国内外普遍采用PCR 结合毛细管电泳的方法检测atxn3基因的CAG 重复长度，基于毛细管电泳仪分析的基因检测方法为目前国内外公认的简便可靠的三核苷酸CAG重复突变检测方法［9］，基于该方法的协作标定试验可为国家参考品的适用性提供可靠的技术支撑。

本次研制的国家参考品来源于永生化细胞系提取的DNA，该样本储存及运输温度均为-20℃，因此需考察样本的冻融稳定性，均匀性考察采取随机原则。实验室使用PCR 结合毛细管电泳法并采用研发试剂盒对参考品进行了三次冻融及三套均匀性样本的检测，结果表明反复冻融后CAG 重复数结果均一致且与参考品的标示值一致，均匀性样本的检测结果也与参考品的标示值一致，说明国家参考品反复冻融及随机检测的结果均可满足实验要求。同时，国家参考品的同类型产品如tcf4 基因［10］和fmr1基因［11］检测国家参考品已销售两年，用户反馈结果均与参考品的标示值一致。

目前，国内外临床检测atxn3基因的核酸检测技术主要包括毛细管电泳［12］、多重PCR 和DNA 片段分析等方法。在atxn3基因检测中，无论突变型和野生型，尚无可供使用的参考品。国家参考品对于试剂盒的质量控制尤为重要［13］，其对试剂盒性能评价、企业出厂检验及产品上市后的监督抽验均是有效的工具［14-15］。