李佳静 荀运浩

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是以迅速进展的肝性脑病、凝血功能障碍和多器官衰竭为主要表现的一组临床症候群，以短期内大面积肝细胞坏死为特征，严重威胁患者的生命[1]。肝移植是目前治疗ALF 最有效的手段，但在临床应用中因供体来源缺乏而受到限制，仅少数患者受惠。目前基于干细胞的肝脏再生研究备受关注，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）作为当下研究的热点，具有低免疫原性、无伦理学争议等优点，是干细胞移植治疗时细胞类型的优先选择。研究表明，MSC 拥有强大的免疫调节、血管调节和肝脏保护特性，而MSC 源性外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-Exo）通过接收细胞旁分泌的生物活性分子，具有与源细胞类似的免疫调节功能，而且更为稳定，免疫原性更低[2-4]。事实上，作为无细胞治疗策略的外泌体已被应用于多种疾病的治疗，如神经系统疾病、心血管系统疾病、免疫系统疾病、呼吸系统疾病、肌肉骨骼系统疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、眼病、皮肤疾病以及癌症等[5]。尽管MSC/MSC-Exo 在调节自身免疫和炎症反应方面具有重要作用，但它们调节免疫细胞和减轻免疫介导的损伤的潜在机制尚未完全阐明。本文将从肝脏免疫微环境、外泌体的生物学特性、MSC/MSC-Exo在ALF 中的免疫调节作用、MSC/MSC-Exo 的临床应用前景等方面展开作一综述。

1 肝脏免疫微环境

MSC/MSC-Exo 可调节肝内免疫微环境，从而抑制免疫介导的肝损伤。MSC 以近分泌（细胞-细胞接触依赖信号）和旁分泌[分泌可溶性因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、吲哚胺2，3-二氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、肝生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IL-1 受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist，IL-1ra）]方式调节肝脏微环境，并调节致病性免疫细胞的表型和功能[6]。MSC-Exo 恢复和维持组织微环境稳态的能力取决于其内含有的蛋白质和RNA 等内容物的生化特性[7]。MSC-Exo 中富含的miRNA 是重要的细胞内调节分子，如通过靶向信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）的miR-223-3p、靶向磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的miR-455-3p、靶向程序性死亡受体-4 的miR-21 和靶向核信号1 的miR-124-3p 等均可负性调节炎症环境[8-9]。

2 外泌体的生物学特性

细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是指被释放到细胞外的脂质双层膜封装的囊泡，通常分为外泌体、微囊泡、凋亡小体等3类。外泌体直径约30～150 nm，内含重要的信息和生物大分子物质如蛋白质、脂质和核酸，其中核酸包括mRNA、非编码RNA 和DNA[10-11]。通过以胞吐形式释放到胞外的特性，使外泌体不仅成为细胞外基质的一部分，还能调节细胞外微环境[12]。细胞外基质中的外泌体可以通过受体-配体相互作用发出信号，可以通过内吞作用被周围靶细胞摄取，也可以通过血液、体液甚至穿过细胞间隙被运送到远隔部位靶细胞，在免疫应答、免疫调节、炎症反应和干细胞表型转化等过程中发挥重要作用[13-15]。因目前本领域的大部分研究并未严格区分外泌体和微囊泡，本综述描述的外泌体也包括具备外泌体特征的EV。

3 MSC/MSC-Exo 在ALF 中的免疫调节作用

肝衰竭最主要的病理生理学特征是肝脏乃至全身的炎症反应和免疫紊乱，较大程度的免疫损伤在短时间内可造成大量肝细胞凋亡和坏死，随后出现缺血、缺氧和内毒素血症，加速肝衰竭进展，即肝衰竭的“三重打击”假说[16]。炎症级联反应和免疫应答失衡在ALF 的发病和转归中起关键作用，因此，缓解炎症反应并调节免疫细胞的活性是肝衰竭治疗的重要选择。

3.1 固有免疫细胞 肝组织可通过诱导免疫细胞活化来启动固有免疫和适应性免疫反应，从而缓解肝损伤。肝损伤与免疫反应之间的不平衡可导致炎症反应和肝细胞损伤的进展。因此，免疫抑制对于肝细胞再生和肝损伤修复是必要条件[17]。近年来研究发现，MSC/MSC-Exo 可有效调节肝脏M1 或M2 型巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）、自然杀伤T 细胞（natural killer T cell，NKT）等先天免疫细胞以及调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）/辅助性T 细胞（helper T cell，Th）17 的平衡，从而介导免疫抑制，进而减轻肝脏的急性炎症反应。

3.1.1 M1 或M2 型巨噬细胞 巨噬细胞在肝脏疾病的发生、发展中起关键作用[18]。巨噬细胞极具可塑性，可以根据环境刺激极化为不同的功能表型，大致可分为M1 型和M2 型[19]。M1 型巨噬细胞可产生高水平的促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等）、活性氮和活性氧，与引起并维持炎症反应有关[20]。相反的，交替激活的M2 型巨噬细胞可产生高水平的抗炎细胞因子（包括IL-10、TGF-β、IL-1ra），具有抗炎和修复的功能[20]。因此，促进巨噬细胞向M2 表型极化对缓解炎症反应和促进组织重塑至关重要。

越来越多的证据表明，MSC/MSC-Exo 可促进巨噬细胞向M2 表型极化，并调节炎症因子释放，从而减轻肝脏炎症损伤。Wang 等[21]研究发现，在脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的肝损伤小鼠模型中，MSC 分泌的PGE2通过抑制TGF-β 活化激酶1 信号和NLRP3 炎症小体激活来阻止巨噬细胞的激活，并通过激活STAT6 和雷帕霉素靶蛋白信号来诱导生成M2 型巨噬细胞，从而促进肝脏炎症消退。Zhao 等[22]研究发现，来自脂肪MSC 的外泌体可以转移到巨噬细胞中，增加M2 表型相关的精氨酸酶-1、IL-10 的mRNA 水平。此外，脂肪MSC-Exo 通过其携带的STAT-3 反式激活精氨酸酶-1来诱导巨噬细胞向抗炎M2 表型极化，并显著抑制由脂多糖和IFN-γ 刺激的巨噬细胞炎症反应。MSC-Exo促进巨噬细胞向M2 表型极化，miR-132、miR-let7 等miRNA 在炎症反应中高度上调，并可能通过调节Toll样受体实现对M2 表型极化的诱导[23]。

3.1.2 Treg 与Th17 比值 Th17、Treg 是CD4+T 淋巴细胞的不同亚群，具有不同的分化途径和功能。产生IL-17 的Th17 表达ROR-γt，而Treg 表达Foxp3 并分泌抗炎细胞因子，可通过抑制巨噬细胞、NKT、B 淋巴细胞的分化和增殖等发挥免疫耐受效应[24]。Th17 与Treg之间的平衡对免疫反应至关重要，尤其是在肝组织受损和免疫稳态恢复过程中[25]。

目前研究认为，MSC/MSC-Exo 可通过调节Treg/Th17 之间的平衡来控制肝脏炎症发展。Xie 等[26]在肝缺血/再灌注损伤小鼠模型中发现，在肝缺氧/复氧微环境诱导下，影响Treg/Th17 比值的相关细胞因子IL-6、IL-17、ROR-γt mRNA 表达上调，但脐带血MSC-Exo可显著抑制该效应，并且促进肝缺氧/复氧微环境对Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA 表达上调的效应；同时脐带血MSC-Exo 通过miR-1246 介导的IL-6-gp130-STAT3 轴来调节Treg/Th17 之间的平衡，促进Th17 向Treg 迁移，从而减轻肝损伤。Court 等[27]研究发现，通过MSC 介导线粒体转移至CD4+T 淋巴细胞的方式，可以强化T淋巴细胞向Treg分化，并通过上调Treg来减轻炎症反应。此外，研究表明MSC-Exo 通过miR-1246/NFAT5 轴、miR-19b/KLF13 轴和mTOR 介导轴以及MSC分泌肝细胞生长因子来平衡Treg/Th17比值[9，28]。

3.1.3 DC DC 是体内已知功能最强的专职抗原提呈细胞，可通过激活T 淋巴细胞来诱导机体初始免疫应答。研究表明，MSC/MSC-Exo 可通过调节DC 表型、减弱DC 的抗原提呈功能、抑制DC 的成熟和增殖等方式来减轻肝损伤。Zhang 等[29]研究发现，在痤疮丙酸杆菌诱导的ALF 小鼠模型中，静脉注射骨髓MSC（bone marrow-derived MSC，BM-MSC）可通过诱导肝脏DC 的调节表型来阻止ALF 的进展。BM-MSC 来源的PGE2通过激活EP4 受体诱导PI3K 和ERK1/2 激酶的磷酸化，并诱导肝脏DC 产生耐受性、免疫抑制表型。耐受性DC 通过诱导T 淋巴细胞无反应或细胞凋亡以及Treg 的产生和增殖来帮助维持免疫耐受，减轻肝脏炎症，遏制ALF 的发展。Reis 等[30]研究发现，MSC-Exo 可导致DC 成熟和活化的表面标志物CD83、CD38 和CD80 表达减少，导致DC 成熟停滞。此外，MSC 还通过下调DC 膜上主要组织相容性复合物Ⅱ类分子、共刺激分子表达以及减少NKT1、NKT17 相关炎性细胞因子的合成来减弱其抗原递呈能力[3，31-32]。此外，MSC 还通过调节肝脏DC 表型和功能间接抑制肝脏NKT 的效应功能[3]。

3.1.4 NKT NKT 被认为是ALF 发病机制中的主要效应细胞，NKT 主要通过与专职抗原呈递细胞（巨噬细胞和DC）和T 淋巴细胞的协同作用，和涉及Fas/FasL相互作用、穿孔素/颗粒酶系统以及IFN-γ、IL-4 和（或）TNF-α 介导的系统的效应机制，导致肝细胞大量坏死[33]。Gazdic 等[34]研究发现，在经α-半乳糖脑苷脂诱导的肝损伤小鼠模型中，MSC 经IDO 信号通路抑制NKT，导致产生TNF-α、IFN-γ 和IL-4 的NKT 总数减少，从而缓解肝损伤。MSC 来源的IDO 及其代谢产物犬尿氨酸主要负责诱导调节性DC，后者又可诱导免疫抑制表型调节性NKT 的产生和增殖[3，32]。MSC 来源的IDO 通过激活一般性调控阻遏蛋白激酶2 来阻止调节性NKT 转分化为促炎性NKT17，并且可通过蛋白激酶B/mTOR 信号通路来抑制调节性NKT 合成炎症细胞因子IL-17 和IL-22[3，34]。

3.2 适应性免疫细胞 T 淋巴细胞和B 淋巴细胞受到MSC/MSC-Exo 的直接调节，也受MSC/MSC-Exo 诱导的天然免疫细胞介导的间接调节[35]。MSC/MSC-Exo 可限制CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、γδT 淋巴细胞和B 淋巴细胞的增殖和激活[36-39]。

目前研究表明，MSC/MSC-Exo 可抑制T 淋巴细胞分化和增殖、调控T 淋巴细胞功能。Zhang 等[29]研究发现，在静脉注射BM-MSC 治疗痤疮丙酸杆菌诱导的ALF 小鼠模型中，对肝脏浸润性CD4+T 淋巴细胞的流式细胞术检测显示，活化细胞表面标志物CD44、CD69的表达减少，表明MSC 可抑制CD4+T 淋巴细胞的激活。MSC 下调Th1 趋化因子CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL21 的产生，因此经BM-MSC 治疗后，小鼠肝脏中表达CXCR3 和CCR5 的效应CD4+Th1 和表达CCR7 的记忆CD4+Th1 减少，伴随着免疫抑制表型Treg 的增加。Blazquez 等[40]的体外实验研究发现，MSC-Exo 对于CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞向效应细胞或记忆细胞表型的分化具有抑制作用，这是由抗CD3/CD2/CD28 刺激介导的。MSC/MSC-Exo 还通过显著减少IFN-γ 的分泌来抑制T 淋巴细胞的活化[40]。在MSC 存在的情况下生成的未成熟DC 不表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86，这会导致Th1 细胞无能[41]。MSC 通过分泌PGE2来抑制依赖DC 介导的初始T 淋巴细胞激活，下调Th1、Th2 中IFN-γ 和IL-4 表达，并刺激Treg 的生成和增殖[41-43]。

目前研究表明，MSC/MSC-Exo 可抑制B 淋巴细胞的增殖、分化和抗体产生。Palomares 等[44]研究发现，经IFN-γ 预处理的MSC 对初始B 淋巴细胞、记忆B 淋巴细胞和总B 淋巴细胞增殖均有较强的抑制作用，并且其抗体和免疫球蛋白的产生也受到明显的抑制。类似的，Khare 等[39]在体外实验中发现MSC-Exo 对B 淋巴细胞特异性mRNA 表达有广泛影响，测序显示186 个基因表达有显著差异，并且免疫球蛋白IgM 的产生也受到显著抑制。Lee 等[45]研究发现，经佛波酯前处理的MSC 以CXCL10 依赖的方式募集B 淋巴细胞，并以细胞程序性死亡-配体1 依赖的方式诱导细胞凋亡并同时抑制免疫球蛋白IgG 的产生。

综上所述，MSC/MSC-Exo 可以抑制多种促炎细胞的活化和增殖，如Th1、Th17、M1 型巨噬细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞等，从而减少促炎细胞因子的分泌，同时促进M2 型巨噬细胞、Treg 等抗炎细胞的增殖，进而调节DC 和NKT 功能，增加抗炎细胞因子的分泌，从而发挥免疫调节作用。

4 MSC/MSC-Exo 的临床应用前景

当MSC 植入体内后，能在损伤组织中发现这些细胞，但数量极少，仅占植入量的2%。在小鼠肝硬化模型中，植入体内的MSC 大部分滞留在肺血管系统内，仅少数达到肝脏[46]。为了提高MSC 治疗的免疫调节效果，多项研究致力于MSC 的预处理策略，包括低氧、炎症因子、三维细胞培养、基因工程方法和药物或化学制剂等方法及其组合。适当的预处理能诱导MSC 释放具有增强抗炎能力的外泌体[47]。经处理的MSC-Exo的免疫调节作用依赖于miRNA（包括miR-216a-5p、miR-125a、miR125b、miR-1260b、miR-146a、miR-146a-5p、miR-210-3p、miR-34a、miR-124、miR-299-3p、miR-21、miR-147b、miRlet-7b、miR1246 和miR-135b等）和蛋白质（包括TGF-β、CD73、IFN-γ、细胞程序性死亡-配体1、IDO、A20、TSG-6 和IL-10 等）作用于靶细胞，再使其表型转化为免疫抑制型[47]。此外，外泌体还是理想的药物递送载体，可将生物活性分子包裹在膜内免受降解，并通过外泌体的细胞内吞作用来促进其在细胞内的摄取。更重要的是，外泌体还能够在不同物种之间传递，且不引起明显的免疫反应，这为外泌体的直接应用提供了巨大优势[48]。但目前关于MSC/MSC-Exo 治疗ALF的临床随机对照研究较少。Lin等[49]研究表明，在乙肝相关慢加急性肝衰竭患者中输注骨髓MSC 能有效挽救肝损伤，试验组（56例）每周输注骨髓MSC并持续4周，与仅接受标准药物治疗的对照组（54 例）相比，24 周生存率明显改善（55.6%比73.2%，P＜0.05），严重感染发生率明显降低，血清TBil水平和终末期肝病模型评分均明显下降。Schacher 等[50]研究表明，在慢加急性肝衰竭2～3 级患者中输注骨髓MSC 安全可行。截至2023 年3月27 日，在美国临床信息公示数据库（https://clinicaltrials.gov）、药物临床试验登记及公示平台（http://www.chinadrugtrials.org.cn）和中国临床试验注册中心（https://www.chictr.org.cn）中关于MSC/MSC-Exo 应用于ALF 的临床试验共13 项，主要包括ChiCTR2100050852、ChiCTR200- 0030332、CTR20230389、CTR20212223、NCT-03863002、NCT03668171、NCT03629015、NCT02857010、NCT0482-2922、NCT02812121、NCT03860155、NCT014-29038、NCT-01724398。可见，MSC/MSC-Exo 是一种有潜在价值的新型ALF 治疗方法。

5 小结

不同来源的MSC/MSC-Exo 在ALF 的免疫调节中起着关键作用，可激活不同的信号转导途径调节免疫细胞功能，维持免疫抑制，进而抑制肝脏疾病的发生和发展；此外，MSC/MSC-Exo 还可以通过旁分泌的方式来影响机体其他组织器官。研究表明，外泌体的功效几乎与源细胞的疗效相匹配，并且是靶向运输的理想载体，提示外泌体具有作为无细胞疗法的潜力，从而解决干细胞移植的安全问题，并提供一种宿主免疫反应最小的选择，但目前这一领域仍处于探索阶段。外泌体的内容物会受到周围微环境的影响，合理的预处理可以调节其产物的含量和组成，以增强免疫治疗效果。随着生物工程的迅速发展，外泌体还可以经过修饰，获得更精准靶向器官、组织和细胞的能力。尽管MSC/MSC-Exo 在ALF 中的初步研究令人鼓舞，但MSC/MSC-Exo 在体外治疗中达到临床疗效之前，仍有许多问题有待回答，比如不同来源MSC/MSC-Exo 的疗效评价、MSC-Exo 用于人体的具体治疗安全剂量和用药方式等。因此，建议继续研究MSC-Exo 的生物安全范围，同时需要大样本的长期体内研究来评估外泌体的利弊。随着研究的深入，相信在不久的将来，MSC/MSC-Exo 有望在肝衰竭精准治疗中具有举足轻重的地位，并将应用于更广阔的医学领域。