刘 坤，杨明昊，周雄峰，白 杨，冉从福

（输变电装备技术全国重点实验室,重庆大学电气工程学院,重庆 400044）

等离子体活化水（Plasma activated water，PAW）是指利用大气压非热等离子体对液体进行处理而得到的活化溶液［1～4］.在处理的过程中，等离子体产生的大量活性物种会通过液相次级反应转移至PAW中，使其含有丰富的活性氧物种（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮物种（Reactive nitrogen species，RNS）［5，6］，在医疗卫生灭菌领域展现出极高的应用价值［7，8］.近年来，研究者发现在大气压放电制备PAW的系统中引入永磁铁产生的磁场能够改变PAW中的化学产物浓度，影响PAW的灭菌应用效果［9～11］.如，Liu等［9］利用0.587 T的磁场辅助大气压等离子体射流处理水溶液，发现此时溶液中的羟自由基（·OH）生成量比无磁场辅助时的生成量提高了0.5倍.Xu等［10］利用0.5 T的磁场辅助大气压等离子体射流制备PAW并用以灭活大肠杆菌和骨髓瘤细胞，结果表明，与单独放电相比，磁场辅助放电制备的PAW 中过氧化氢（H2O2）与超氧根阴离子自由基（）浓度能分别增加12%和25%，此时，大肠杆菌和骨髓瘤细胞的存活率分别从43%和60%下降至26%和36%.Tschang 等［11］利用0～2 T 的磁场辅助大气压等离子体射流处理水溶液，发现通过调节磁场强度可以调控溶液中生成的H2O2、硝酸根离子和亚硝酸根离子的浓度及其比例关系.可以看出，磁场能够影响放电制备的PAW中的化学产物浓度，并以此影响PAW的生物灭活效果，有利于提升PAW在生物医学领域的应用潜力.但是现有研究集中在磁场对大气压等离子体射流制备PAW的影响，而等离子体射流制备PAW因其处理面积相对较小，因此单位时间内的制备量相对较少、制备效率较低、不利于大规模PAW需求的应用拓展.

大气压沿面介质阻挡放电（Surface dielectric barrier discharge，SDBD）作为一种常见的大气压放电等离子体源［12～16］，可以在大气压条件下于介质表面产生较大面积的等离子体层，是大规模制备PAW的理想放电结构.但是，目前关于磁场影响SDBD 制备PAW 的实验研究还未见报道，磁场辅助SDBD 制备的PAW的化学特性及其灭菌效果还需进一步验证与分析.因此，本文利用永磁铁产生的均匀磁场辅助SDBD制备PAW，对比研究了不同放电电压与放电频率下有无磁场辅助时放电制备PAW的酸度、电导率及H2O2和过氧亚硝酸（ONOOH）的浓度等溶液性质差异，并结合空气SDBD等离子体气液两相的相关化学反应体系网络，分析了磁场影响SDBD制备PAW的物理化学机制；此外，选取大肠杆菌作为指示菌，比较了不同放电条件下有无磁场制备的等离子体活化水的灭菌效果.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

对氨基苯磺酸（分析纯）、N-（1-萘基）乙二胺（分析纯）和辣根过氧化物酶（HRP），上海阿拉丁试剂公司；H2O2探针（Amplex Red），上海懋康生物科技公司.

高压交流电源，重庆大学电气工程学院；P6015A型高压探头，美国Tektronix公司；GDS2304A型数字示波器，台湾Gwinstek公司；TD8650型高斯计，长沙tunkia公司；UV-2200型紫外分光光度计，北京Beifen-Ruili 公司；RF-6000 型荧光分光光度计，日本Shimadzu 公司；PHS-25 型pH 计，上海Leici 公司；DDS-11A型电导仪，上海Leici公司；RI-150型恒温培养箱，美国Thermo-Fisher公司.

1.2 实验过程

1.2.1 实验装置 磁场辅助SDBD制备PAW用于灭菌的实验装置如Scheme 1（A）所示，主要由PAW制备单元与磁场建立单元以及相关测量仪器构成.PAW制备单元由SDBD反应器和石英玻璃腔室构成.SDBD 反应器由9 根条状钨电极、1 块面状钨电极和1 块陶瓷板绝缘介质3 部分构成，其放电形貌如Scheme 1（B）所示.SDBD反应器更详细的参数见文献［17，18］.石英玻璃腔室内盛有10 mL待处理的去离子水.将SDBD 置于腔室内，与液面之间的距离为6 mm，每次放电处理150 s.驱动SDBD 的高压交流电源由实验室自主研发［19］，输出电压范围为峰-峰值0～26 kV，频率范围4～20 kHz，电压抖动小于0.2 kV.电压信号由高压探头采集，然后显示在数字示波器上，以此来确定施加的放电电压和频率.实验中为了获得较稳定的放电，选取放电参数调节范围为：放电电压峰-峰值5.5～6.5 kV，频率6.5～9.0 kHz.磁场建立单元由两块相向排列的钕铁硼（Nd2Fe14B）永磁铁构成.两块永磁铁相距8.5 cm，PAW制备单元放置在其中.利用高斯计测得放电空间内的磁感应强度大小约为55 mT.放电制备PAW所需的能耗可以通过放电功率和放电处理时间（150 s）得到，其中放电功率随放电电压和放电频率条件变化而改变，其具体数值可以通过Lissajous图形法计算得到［20］.

Scheme 1 Experimental setup of magnetic field assisting SDBD to prepare PAW(A) and SDBD discharge image(B)

1.2.2 溶液性质检测 实验中对有无磁场情况下放电制备的PAW中的H2O2和ONOOH等活性物种进行检测.其中，的测量原理如下［21］：利用紫外分光光度计测量PAW在220和275 nm波长处的吸光度（A220和A275），然后由A220－2A275得到的吸光度［图1（A）］.的测量原理如下［22］：与对氨基苯磺酸反应的产物能与N-（1-萘基）乙二胺溶液反应生成玫瑰红色复合物，利用紫外分光光度计测量该复合物在540 nm波长处的吸光度值［图1（B）］.H2O2的测量过程如下［23］：H2O2在辣根过氧化物酶的作用下氧化H2O2探针生成具有荧光效应的产物，利用荧光分光光度计测量在571 nm波长光照射下585 nm 波长处的荧光强度［图1（C）］.ONOOH 测量过程如下［24］：ONOOH 与特异性探针（自制）反应生成具有荧光效应的产物，利用荧光分光光度计测量在600 nm波长光照射下646 nm波长处的荧光强度［图1（D）］.利用上述吸光度值或荧光强度值，结合相应的定标曲线，即得到PAW不同活性物种的浓度.实验中PAW的pH值和电导率分别利用pH计和电导仪进行测量.

Fig.1 Absorbance curve or fluorescence curve for measuring nitrate ion(A),nitrite ion(B),hydrogen peroxide(C) and peroxynitrous acid(D)

1.2.3 灭菌效果表征 利用大肠杆菌（E.coli）进行PAW的生物灭活效应评价.分别制备无磁场与有磁场时不同放电条件下的PAW，取10 μL大肠杆菌菌液与1000 μL PAW混合，然后利用涡旋振动器振动5 s混匀；混合液静置5 min后按10倍梯度稀释法进行梯度稀释，并接种于LB固体培养基中；将接种后的培养基放置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h［25］.图2为有无磁场辅助情况时，在6.5 kV，6.5 kHz条件下放电制备的PAW的灭菌效果示意图，图中的数字表示稀释的倍数，对照组表示用去离子水处理.采用菌落形成单位（Colony forming units，CFU）表示微生物的存活数量，用平板计数法统计LB培养基上的菌落数目［26］，本文使用的大肠杆菌原始浓度为5.5×108CFU/mL，检出限为102CFU/mL.

Fig.2 Bacterial colony diagram treated by PAW prepared with conditions of control group(A),solo SDBD(B) and magnetic field assisted SDBD(C)

2 结果与讨论

2.1 溶液性质

图3（A）～（F）分别示出了无磁场以及有磁场辅助下放电制备的PAW 的pH 值、电导率以及H2O2与ONOOH的浓度随放电电压和放电频率的变化规律.可知，在不同的放电电压和放电频率条件下，磁场辅助放电制备的PAW有更高的酸性、电导率以及H2O2与ONOOH 浓度.如在最低放电条件（5.5 kV，6.5 kHz）下，相比于无磁场情况时，磁场辅助使所制备PAW 的pH 值从6.4降低到6.2，电导率从394.0 μS/cm 增大到465.0 μS/cm，H2O2与ONOOH 的浓度 从1.39 mmol/L，28.18，13.89 和5.64 μmol/L 增大到1.92 mmol/L，41.97，27.45 和7.50 μmol/L.在最高放电条件（6.5 kV，9.0 kHz）下，相比于无磁场情况时，磁场辅助使所制备PAW的pH值从2.6降到2.3，电导率从1680.7 μS/cm 增大到1852.3 μS/cm，H2O2与ONOOH 的浓度 从6.58 mmol/L，541.90，143.58和7.57 μmol/L增大到7.19 mmol/L，675.47，226.02和10.27 μmol/L.

Fig.3 pH value(A),conductivity(B),concentrations of nitrate ion(C),nitrite ion(D),hydrogen peroxide(E),and peroxynitrous acid(F) of PAW solution properties with and without magnetic field

从上述数据还可以看出，磁场辅助高电压-高频率的放电对于PAW 溶液性质的提升效果更显著.如在最高放电条件（6.5 kV，9.0 kHz）下，磁场辅助使得PAW的pH值降低了0.3，并且电导率及，H2O2和ONOOH 的浓度分别增加了171.6 μS/cm，0.61 mmol/L，133.57，82.44 和2.7 μmol/L；但是在最低放电条件（5.5 kV，6.5 kHz）下，磁场辅助时，PAW 的pH 值仅降低了0.2，电导率及H2O2和ONOOH的浓度仅分别增加了71 μS/cm，0.53 mmol/L，13.79，13，56和1.86 μmol/L.

2.2 磁场辅助放电制备PAW化学活性提升的机理

在空气SDBD放电制备PAW的体系中引入磁场时，放电等离子体气相空间内的电子受洛伦兹力作用，其运动轨迹发生改变［27］，进而影响其从电场中获得的能量.如表1［28～34］所示，电子碰撞反应（R1～R5）的反应速率系数是电子平均能量（ε）的函数，因而磁场能够通过作用于电子从而影响相关电子碰撞反应的进程.大量文献表明磁场的加入会使得ε增大［35～37］.此时，电子与空气中的氮气、氧气和水分子等粒子的碰撞反应的反应速率系数增大，促进产生更多的激发态氮分子N2（A）、激发态氮原子·N（2D）、激发态氧分子O2（a）、氧原子·O以及羟自由基·OH等粒子.为链式化学反应R6～R9提供了更多的反应物，促进了·NO和H2O2的产生.而·NO作为重要的前体物，可以通过R10～R12生成气相HNO2和HNO3.因此，磁场的加入有利于SDBD在气相区域生成更多的H2O2，HNO2和HNO3等活性物种.

Table 1 Related reaction process for preparing PAW by an air discharge plasma

磁场影响放电等离子体气相产物后，会进一步影响通过液相次级反应转移至PAW中的活性物种.相关研究表明，大气压放电等离子体与液体相互作用时，液相中的H2O2，主要来源于气相H2O2，HNO2和HNO3溶解所产生［22，38］.Scheme 2 给出了SDBD 中考虑的生成PAW 活性物种的主要反应过程.磁场加入SDBD 时气相中增加的H2O2，HNO2和HNO3等活性物种通过传质过程溶于液相，使得液相中的H2O2，H+，等粒子浓度增加（R13和R14，反应式中的aq表示液相），从而使得图3中表征的PAW溶液性质提升.因此，磁场辅助SDBD制备PAW时，通过磁化电子来影响电子碰撞反应和后续的链式化学反应和液相次级反应，促进溶液中H+，和ONOOH等活性物种的生成.

Scheme 2 Main reaction network for generating reactive species in PAW

2.3 灭菌效应

图4（A）～（C）分别为无磁场以及有磁场辅助下放电制备的PAW对大肠杆菌的灭菌效果随放电电压和放电频率的变化规律，图中的红色虚线表示检出限（102CFU/mL）.可见，在所有相同的放电电压和放电频率下，磁场辅助放电制备的PAW都能显著增强对大肠杆菌的灭活效果.如无磁场时，最高放电条件（6.5 kV，9.0 kHz）下制备的PAW 处理时，大肠杆菌的存活数量仅能从对照组的5.5×108CFU/mL降至1.2×108CFU/mL，杀灭率仅约为78%［图4（C）］.而相同的放电条件下，磁场辅助放电制备的PAW处理时，大肠杆菌的存活数量低至检出限（102CFU/mL），杀灭率在99.9999%以上.即使在最低的放电条件（5.5 kV，6.5 kHz）下，磁场辅助SDBD制备的PAW处理时，大肠杆菌的存活数量也能从对照组的5.5×108CFU/mL显著下降至6.6×105CFU/mL［图4（A）］，而此时相同放电条件下无磁场辅助SDBD制备的PAW 处理时，大肠杆菌的存活数量还高达1.1×108CFU/mL.上述现象表明，磁场辅助放电制备的PAW显著提高了对大肠杆菌的灭菌效果；而且对于获得相同的杀菌效果，磁场的引入显著降低了所需的放电电压和频率，也意味着此时能耗降低.5.5 kV，6.5 kHz下有磁场辅助制备的PAW［图4（A）］和6.0 kV，8.5 kHz下无磁场辅助制备的PAW［图4（B）］处理时，大肠杆菌的存活数量相差不大，分别为6.7×108和7.5×108CFU/mL，但此时前者制备PAW所需的能耗（2337 J）仅为后者（5625 J）的41.5%；而且有磁场辅助放电制备的PAW 处理时，使大肠杆菌存活数量低至检出限所需的最低能量也仅需为5574 J［对应图4（A）中5.5 kV，8.5 kHz情况］，低于5625 J.

Fig.4 Sterilization effect of PAW prepared under 5.5 kV(A),6.0 kV(B),6.5 kV(C) with different frequencies

此外，对比图4（A）～（C）还可见，磁场辅助高电压-高频率放电制备的PAW对于杀菌效果的提升效应更显著.如在最低的放电条件［5.5 kV，6.5 kHz，图4（A）］下，磁场辅助放电制备的PAW 的杀菌效率仅能提高3个量级；而在最高的放电条件［6.5 kV，9.0 kHz，图4（C）］下，磁场辅助放电制备的PAW的杀菌效率则提高了6 个量级，此时，大肠杆菌的存活数量低至检出限.而且随着放电频率或电压的升高，磁场辅助放电制备的PAW使大肠杆菌存活数量低至检出限所需的放电电压或频率会降低.如图4（A）所示，固定放电电压为5.5 kV，此时，磁场辅助放电制备的PAW使大肠杆菌存活数量低至检出限所需的放电频率为8.5 kHz；而如图4（C）所示，当固定放电电压为6.5 kV时，此时，使大肠杆菌存活数量低至检出限所需的放电频率降至7.5 kHz.

PAW 中的氢离子（H+）提供了酸性的环境，H+对于病原体的灭活提供了一定的作用［39］.PAW 中的H2O2具有强氧化性，其在消毒灭菌等应用中也扮演了重要角色［40］.此外，也有研究表明，H2O2和H+反应生成的ONOOH（R15）是杀菌的关键物质［41，42］.为了更直观体现H+，H2O2和ONOOH 等活性物种与杀菌效率之间的关联，绘制了大肠杆菌存活数量随PAW 的pH 值、H2O2与ONOOH 浓度的变化规律图（图5）.可见，大肠杆菌存活量的确随PAW的酸性、H2O2以及ONOOH浓度的增加而下降.如无磁场辅助放电时，当PAW 的pH 值从6.4 降至2.6、H2O2浓度从13.89 μmol/L 增至143.58 μmol/L、ONOOH浓度从5.64 μmol/L 增至7.57 μmol/L 时，大肠杆菌的存活数量将从1.1×108CFU/mL 降至1.2×105CFU/mL.因此，磁场辅助SDBD制备PAW时，可以通过磁化电子来影响电子碰撞反应和后续的链式化学反应和液相次级反应，从而促进溶液中H+，和ONOOH等活性物种的生成，进而提高杀菌效果.如有磁场辅助放电时，PAW的最低pH值能降至2.3，最高H2O2和ONOOH的浓度能分别提升至226.02和10.27 μmol/L，此时，大肠杆菌的存活数量将低至检出限.值得注意的是，在图5中，当无磁场与存在磁场情况下制备的PAW中的pH值、H2O2和ONOOH浓度三者中某两个指标达到近似相同值时，此时另外一个指标不同，大肠杆菌的存活量却相差很大.如磁场辅助6.5 kV放电制得H2O2和ONOOH浓度相近的两种PAW（图5红色圆圈标记点），但是由于此时溶液pH值相差较大，两种PAW的杀菌性能存在很大差异.而且，较低的pH值并不能保证大肠杆菌杀灭率始终很高［图5（A）］.上述现象说明PAW对大肠杆菌的灭活效应主要来自于三者的协同作用.如Ma等［43］发现，H+，H2O2和ONOOH 3种粒子能协同产生超氧阴离子自由基（）和单线态氧1O2，显著提升PAW的杀菌性能.同时，上述灭菌率的突变现象也说明实现高效杀菌（大肠杆菌存活数量基本低至检出限）会存在阈值浓度（所需的最低pH值为4.2，H2O2与ONOOH 浓度分别为93.31 与8.26 μmol/L），只有当这三者条件同时满足时才会实现高效杀菌［图5（B）和（C）］.此外，上文提到在高电压-高频率下磁场辅助放电对于PAW 溶液性质的提升效果更明显，与杀菌效应的提升效果也最显著相对应.

Fig.5 E. coli survival varying with pH value(A),H2O2 concentration(B) and peroxynitrous acid concentration(C) of PAM

磁场辅助SDBD放电制备的PAW能实现大肠杆菌高效杀灭，杀菌率能达到99.9999%以上（此时大肠杆菌存活数量低至检出限102CFU/mL）.通过图3～图5的结果可知，实现高效杀菌（大肠杆菌存活数量基本低至检出限）所需的最低pH 值为4.2，H2O2与ONOOH 浓度分别为93.31 和8.26 μmol/L.上述PAW的pH值与人体皮肤pH值（4.5～6.5）较接近、H2O2浓度远低于医用消毒领域所用3%H2O2浓度（摩尔浓度为0.89 mol/L）、ONOOH 易分解无残留.可以预见，利用磁场辅助SDBD 制备的PAW 在医疗卫生灭菌领域应用时符合生物安全性.

3 结论

利用永磁铁产生的均匀磁场辅助大气压SDBD 处理去离子水制备PAW，研究了施加交流电压5.5～6.5 kV、频率6.5～9.0 kHz 范围内有无磁场时放电制备的PAW 溶液的pH 值、电导率以及H2O2与ONOOH浓度等性质的差异，并结合空气SDBD与液体相互作用时气液两相的相关化学反应体系网络，分析了磁场影响放电制备PAW的物理化学机理.结果表明，在不同的交流电压和频率放电条件下，磁场的加入能影响放电空间的电子碰撞反应，进而影响后续的链式化学反应和液相次级反应进程，从而提高SDBD制备的PAW的化学活性，增强对大肠杆菌的杀灭效果.此时，对于获得相同的杀菌效果，磁场的引入显著降低了所需的放电电压和频率，降低了能耗.随着放电频率/电压的升高，PAW的化学活性增强，此时磁场辅助放电制备的PAW使大肠杆菌存活数量低至检出限（杀灭率在99.9999%以上）所需的放电电压/频率会降低.磁场辅助高电压-高频率的SDBD对于PAW化学活性的提升效果更显著，此时H+，H2O2和ONOOH 等活性物种之间的协同效应加强，杀菌效果的提升也最明显.研究结果为大气压放电制备PAW 提供了新见解，尤其是提出的磁场辅助SDBD 放电制备PAW 的方法能够有效提高PAW的灭活能力并降低PAW的制备成本，有利于推动PAW在医疗卫生灭菌等领域的发展.