马纪　孔玄庆　喻快　欧阳文森　李雨露　金晨钟　郭军　李建明　欧晓明

摘 要 为评估甲基嘧啶磷对水生生物的毒性效应，在实验室条件下，以斜生栅藻、大型溞和斑马鱼为试验研究对象，参照OECD试验指南和《化学农药环境安全评价试验准则》，研究甲基嘧啶磷对这3种水生生物的急性毒性。结果：甲基嘧啶磷对斜生栅藻的生物量半抑制浓度（72 h-EyC50）为1.437 mg·L-1（a.i.）、生长率半抑制浓度（72 h-ErC50）为2.678 mg·L-1（a.i.）；对大型溞的活动半抑制浓度（48 h-EC50）为5.27×10-3 mg·L-1（a.i.）；对斑马鱼的半致死浓度（96 h-LC50）为0.496 mg·L-1（a.i.）。根据毒性等级划分标准，甲基嘧啶磷对斜生栅藻、大型溞、斑马鱼分别为中毒、剧毒和高毒。表明甲基嘧啶磷对水生生物毒性较高，在使用过程中，应避免其进入流动水体，防止对湖泊、河流等水生生态系统造成危害。

关键词 甲基嘧啶磷；急性毒性；斜生栅藻；大型溞；斑马鱼

中图分类号：S181 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.17.002

甲基嘧啶磷（Pirimiphos-methyl）是1974年英国帝国化学工业集团开发的一种低毒、高效、低残留的嘧啶类有机磷杀虫杀螨剂[1]，属于胆碱酯酶（ChE）抑制剂，其致毒机理为阻抑昆虫神经突触上乙酰胆碱酯酶（AchE）的活性，引起乙酰胆碱（ACh）蓄积，使胆碱神经受到持续冲动，导致害虫持续兴奋后死亡[2-4]。常被用于粮食仓储防虫，是联合国粮农组织和世界卫生组织推荐使用的储粮防护剂[5]。目前对甲基嘧啶磷的研究主要集中在合成开发和复配[6]、仓储防效[7-8]、残留[9-10]、分析方法开发[11]及废水处理[12]。甲基嘧啶磷在农药登记中均为卫生杀虫剂或用于仓储杀虫，其除了对仓储害虫具有很好的防效外，还对田间害虫具有一定的活性，可进行甲基嘧啶磷农药登记使用范围的扩大研究。有研究表明[13]，有机磷农药喷洒后一般只有10%～20%的药液在作物上附着，剩余大部分均残存在土壤、水和大气中，之后随着降水、沉降和径流的冲刷而进入地下水和江河湖泊中，进而对水生生物造成影响。因此，有必要研究甲基嘧啶磷对水生生物的毒性效应，从而更加全面、可靠地评价甲基嘧啶磷的环境安全性。

目前常用于污染物毒性评价的水生生物主要有藻类、溞类和鱼类。藻类作为水生生态系统的初级生产者，是评价水环境质量和污染物生态毒性的关键生物，如被研究者广泛应用到水环境毒理试验中的斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）对环境污染程度就有着高度敏锐性[14]。溞类是浮游动物的主要构成部分，对水生生态系统的功能、结构和生物生产力起着至关重要作用。溞类中研究使用最多的是大型溞（Daphnia magna），其分布范围广，并对毒物具有较高的敏锐性，因此常用于评价水质的好坏，是国际上标准的试验生物[15]。斑马鱼（Brachydanio rerio）具有易培养、繁殖速度快、对水体污染程度敏感等优点，是水生毒性试验的标准试验生物[16]。因此，本研究参照OECD测试指南[17-19]和《化学农药环境安全评价试验准则》[20]，选择斜生栅藻、大型溞和斑马鱼3种位于水生生态系统中不同营养级的生物进行甲基嘧啶磷的急性毒性试验，以此评价其对三种水生生物的毒性等级，为后续评价甲基嘧啶磷的环境危害和风险提供理论依据，并对其开发利用具有一定的指导意义。

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

主要仪器：万分之一电子天平（日本岛津公司，AUY220型）； 高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器和化学工作站，日本岛津公司，LC-20A型）；紫外可见分光光度计（日本岛津，UV-1750型）；生物显微镜（上海光学仪器厂，XSP-2C-1型）；便携式多参数数字化分析仪（美国哈希，HQ40d）；水总硬度测定仪（上海三信仪表厂，YD200型）。

主要试剂：丙酮（分析纯）、吐温-80（分析纯）、磷酸（色谱纯），购于国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯），由美国Honeywell公司生产；90.0%甲基嘧啶磷原药，由湖南海利化工股份有限公司生产；曝气24 h以上的去氯自来水，由实验室提供；水生4号培养基、ISO标准稀释水根据《化学农药环境安全评价试验准则》[20]配制，现配现用。

1.2  供试生物

大型溞，实验室自培養，引种自中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。试验选用室内孤雌繁殖3代以上、出生24 h内健康活泼的非头胎溞。

斑马鱼，购买于长沙市湘阳水族馆。试验前将斑马鱼置于实验室条件下（光照与黑暗时间比例为

16 h∶8 h，温度21～24 ℃）驯养7 d以上，驯养期间及时清除粪便及食物残渣，死亡率在5%以下方可用于试验。在试验项目开展前24 h停止饲喂，挑选体长

（2.0±1.0） cm健康活泼的个体用于试验。

斜生栅藻，实验室自培养，引种于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在实验室条件下使用10%水生4号培养基（HB-4）进行转接扩大培养，使用转接培养3次以上且达到同步生长的藻液用于试验。

1.3  试验方法

1.3.1  藻类生长抑制毒性试验

根据预试验结果，设置理论浓度为20.82、29.15、40.82、57.14、80.0 mg·L-1（a.i.）。称取甲基嘧啶磷原药，用丙酮溶解后加入吐温80 搅匀，之后用10%水生4号培养液分别稀释至2倍设置浓度，再与藻细胞浓度为2.00×104个·mL-1的藻液进行1∶1体积混合后，置于250 mL无菌三角瓶中，手动摇匀，试验中同时设置空白对照和溶剂对照，各处理配制3个重复。试验藻液摇匀后放入人工气候箱中培养观察72 h（设置温度为23 ℃，光照与黑暗时间比例为6 h∶6 h，光强为7 200 lx），每天人工摇匀3～5次。每间隔24 h 测定藻液中藻细胞数和记录中毒症状，并计算生长半抑制浓度EC50。

1.3.2  溞类急性活动抑制试验

根据预试验结果，试验采用半静态法，每隔24 h更换试验药液，设置浓度为7.00×10-3、9.10×10-3、0.011 8、0.015 4、0.02 mg·L-1（a.i.）。称取甲基嘧啶磷原药，用丙酮溶解后加入吐温80搅匀，然后用ISO 标准稀释水分别配制成上述浓度，试验过程中同时设置空白对照组和溶剂对照组，每处理设置5个重复，其中4个重复中接入10只试验用溞，1个重复进行水体环境的检测，染毒完成后放入恒温光照培养箱内培养48 h（设置温度为20 ℃，全黑暗），每间隔24 h观察幼溞的中毒症状和记录受抑制数，并计算活动半抑制浓度EC50。

1.3.3  鱼类急性毒性试验

根据预试验结果，试验采用半静态法，每隔24 h更换试验药液。设置浓度为0.965、1.16、1.39、1.67、2.0 mg·L-1（a.i.）。称取甲基嘧啶磷原药，用丙酮溶解后加入吐温80搅匀，用去氯处理24 h以上曝气自来水稀释成设置浓度，分别投入10尾鱼，在水浴温度为24 ℃，全黑暗的条件下培养96 h，试验同时设置空白对照和溶剂对照，各处理不设重复。每日观察并记录各处理中斑马鱼的死亡情况和中毒症状，并计算半致死浓度LC50值。

1.4  药液浓度质量检测

为确保试验结果的准确可靠，参照张国生等[21]的分析方法并加以调整，建立了甲基嘧啶磷在不同试验生物培养溶液体系中的浓度分析方法，并对该方法进行验证。绿藻试验0 h、24 h、48 h、72 h取样检测，大型溞试验0 h、24 h换药前、48 h取样检测，斑马鱼试验0 h、24 h换药前和96 h取样检测。高效液相色谱仪的分析条件为色谱柱：InertSustain C18，250 mm×4.6 mm（i.d）不锈钢柱，5 μm；柱温：40 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相：V（甲醇）∶V（纯水）＝80∶20。在上述条件下，甲基嘧啶磷的保留时间约10.4 min；采用外标法定量。

1.4.1  标准曲线绘制

采用万分之一电子天平准确称取0.052 4 g甲基嘧啶磷标准品置于小烧杯中，用甲醇配制成浓度为500 mg·L-1（a.i.）的标准溶液100 mL。再用甲醇稀释成甲基嘧啶磷0.02、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0 mg·L-1（a.i.）浓度的系列标准溶液，取样上机检测。以峰面积总和y、进样浓度（mg·L-1）x作标准曲线，得到标准曲线方程为y=56 796.43x+554.40（R2=0.999 9），结果表明甲基嘧啶磷在2个浓度区间内线性均为良好。

1.4.2  样品前处理方法

藻试验和鱼试验水样：量取20 mL试验水样，转移至50 mL的离心管中，加入20 mL乙腈和3 g氯化钠，用手剧烈震荡5 min，然后静止3 min，取上层乙腈相，过0.45 μm滤膜待测。溞试验水样：由于对大型溞急性毒性试验组浓度较低，故需对水样进行浓缩，量取100 mL试验水样，转移至250 mL的分液漏斗中，加入5.0 g氯化钠，分别用50 mL二氯甲烷萃取3次，过无水硫酸钠，转移至三角瓶中，旋蒸（50 ℃）浓缩至近干，用2 mL甲醇溶液定容，过0.45 μm滤膜待测。

1.4.3 ; 添加回收

分别向绿藻培养液、大型溞培养液和曝气自来水中添加甲基嘧啶磷标准品配制的溶液，使其浓度分别为0.05、0.1、1.0、10 mg·L-1（a.i.）；0.002 mg·L-1（a.i.）和0.02 mg·L-1（a.i.）；0.05、0.5、5.0 mg·L-1（a.i.），每个浓度设置5个重复，上机检测，结果见表1。绿藻培养液中，添加回收率在92.50%～103.72%范围内，相对标准偏差分别为0.86%、2.75%、0.63%和0.39%；在大型溞培养液中，添加回收率在82.84%～95.28%，相对标准偏差为1.30%和0.60%；在曝气自来水中，添加回收率在97.66%～105.20%，相对标准偏差为1.80%、0.92%和0.41%。本分析方法符合各验证内容的质量控制要求，可用于分析检测甲基嘧啶磷在各基质中的浓度。

1.5  数据处理

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析处理，根据质量浓度的对数和抑制数/死亡数进行线性拟合，分别计算甲基嘧啶磷对斜生栅藻、大型溞、斑马鱼的毒力方程、EC50/LC50 及其95%置信限。

2  结果与分析

2.1  中毒症状

在试验周期内，各试验条件均符合试验要求。斜生栅藻试验中，为减少光解，将光照时间进行了调整，采用6 h光照和6 h黑暗交替，温度范围为21.2～23.7 ℃，光强为6 881～7 193 lx，pH值为7.19～8.01；大型溞试验中，试验用水的硬度为141 mg·L-1，试验期间温度范围为19.0～21.7 ℃，溶解氧范围为7.75～8.22 mg·L-1，pH值范围为7.38～7.61，全黑暗处理；斑马鱼试验中，试验用水的水质硬度为107 mg·L-1，温度范围为22.0～24.6 ℃，溶解氧范围为7.58～8.42 mg·L-1，pH值范围为7.54～8.15，全黑暗处理。

試验期间，3种供试生物的空白对照组与溶剂对照组未出现异常，大型溞和斑马鱼中未出现死亡。斜生栅藻试验中，随着甲基嘧啶磷浓度升高，藻液中藻细胞数量减少，通过镜检观察可发现高浓度处理中藻细胞个体偏小，72 h时观察发现高浓度处理中的藻液颜色明显浅于低浓度，具有明显的梯度；大型溞试验中，药剂处理中的大型溞均出现了活动抑制的个体，且抑制数与药剂浓度呈正相关，部分大型溞游动迟缓、沉于杯底或漂浮于水面；斑马鱼试验中，主要症状表现为活动能力变弱、部分浮于水面游动且游动缓慢，高浓度组中毒斑马鱼部分失去平衡、鳃部充血，试验过程中斑马鱼死亡数与染毒浓度呈正相关。

2.2  毒性效应

各试验中药液的浓度分析结果见表2。斜生栅藻试验中，每24 h进行药液浓度检测，试验结束时，浓度变化率为29.86%～41.11%，因此在数据统计分析中以实测浓度的几何平均值进行计算；大型溞和斑马鱼试验中每24 h更换试验药液，其浓度变化率均未超过20%，在数据分析中，采用0 h时的实测浓度。

甲基嘧啶磷对3种水生生物的毒性浓度详见表3。对斜生栅藻生长率的72 h半抑制浓度（72 h-ErC50）为2.678 mg·L-1（a.i.），95%置信区间为2.419～3.060 mg·L-1（a.i.）；对斜生栅藻生物量72 h-EyC50为1.437 mg·L-1（a.i.），95%置信区间为1.338～1.539 mg·L-1（a.i.）。72 h-EyC50数据较72 h-ErC50数据小，其毒性更高，因此，利用72 h-EyC50值对斜生栅藻的毒性等级进行判定。对大型溞48 h-EC50为5.27×10-3 mg·L-1（a.i.），95%置信区间为4.76×10-3～5.83×10-3 mg·L-1（a.i.）。对斑马鱼96 h-LC50为32.69 mg·L-1（a.i.），95%置信区间为0.428～0.584 mg·L-1（a.i.）。根据毒性分析结果可知，随着暴露时间的延长，甲基嘧啶磷对大型溞和斑马鱼的LC50/EC50数值越小，可见甲基嘧啶磷暴露对这两种生物的毒性随时间推移越高。根据《化学农药环境安全评价试验准则》[20]，可判定甲基嘧啶磷对斜生栅藻为中毒，对大型溞为剧毒，对斑马鱼为高毒。

3  结论与讨论

本研究中，甲基嘧啶磷对3种水生生物的毒性具有一定的差异，对大型溞毒性最高，斑马鱼次之，斜生栅藻最低。甲基嘧啶磷属于有机磷硫代磷酸酯类化合物，有研究表明有机磷类杀虫剂会对水生动物神经系统造成损害，其主要原因是水生动物的AChE更容易与有机磷结合形成稳固的磷酰化胆碱酯酶，导致ACh代谢紊乱，在水生动物体内大量堆积，使其受体持续兴奋，引起动物体抽搐麻痹，最终死亡[22-24]，因此，甲基嘧啶磷对大型溞和斑马鱼的活性高于斜生栅藻；同时，还有研究表明硫代磷酸酯类有机磷杀虫剂在短时间暴露下会影响鱼类嗅觉，造成严重的行为障碍[25]，本研究结果与此结论相符。同时，Berntssen等还从染毒甲基嘧啶磷的大西洋鲑鱼的肝脏、肌肉、肾脏和胆汁中鉴定出甲基嘧啶磷代谢物[26]。综上所述，在甲基嘧啶磷的使用中，应避免其进入施用地周边的流动水体，防止药液进入湖泊、河流对水生生态系统造成危害。

本研究结果表明，甲基嘧啶磷对斜生栅藻为中毒、对大型溞为剧毒、对斑马鱼为高毒，可见其对水生生物的毒性较高，但只根据急性毒性数据不能全面、准确地反映甲基嘧啶磷对水生生态系统存在的风险。在农药登记资料中，环境影响部分需提供化学农药对水生生物的毒性资料，结合PPDB、EPA、EFSA等数据库所得的甲基嘧啶磷的理化性质、环境归趋和GAP使用方法等方面的数据信息，采用TOP-RICE模型[27]和《环境风险评估指南》[28]进行甲基嘧啶磷对水生生态系统的环境风险评估，利用模型計算出的预测环境浓度（PEC）和毒性终点数据、不确定因子计算出预测无效应浓度（PNEC）比值，判断风险的可接受程度，以此评价农药对水生生态系统的风险性。本研究为甲基嘧啶磷进一步的风险评估提供了生态毒理方面的数据支撑。

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（责任编辑：丁志祥）

收稿日期：2023-03-09

作者简介：马纪（2000—），女，湖南汨罗人，在读硕士，主要研究方向为农药生态毒理。E-mail：2176466048@qq.com。

*为通信作者，E-mail：xmouhn@163.com。