赵燕颖， 韩振琦， 邹艳平， 李云鹏， 徐 涛， 刘丽艳， 程海涛

1 长春中医药大学附属医院消化内镜科， 长春 130021； 2 吉林省一汽总医院消化内科， 长春 130011

目前肝癌的复发率仍较高，如何更好的预防肝癌和开发新的治疗方法是临床有待于攻克的难题［1］。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一种生物活性磷脂介质，在体内信号转导过程中引起多种生物学效应，如参与心脏成纤维细胞的生长调节，促进平滑肌收缩［2］、参与肿瘤细胞生长、侵袭、转移。研究［3-4］报道LPA 在多种肿瘤发生、发展中起重要作用。本文主要是探讨LPA 与肝癌恶性进展作用的相关性以及具体机制，并就LPA 相关的信号通路在肝癌靶向治疗中的前景进行讨论。

1 资料和方法

1.1 ELISA法测定LPA

1.1.1 研究对象 选取2016 年1 月—2022 年12 月吉林省一汽总医院诊治的伴有腹腔积液的肝癌患者26例，男16例，女10例，年龄39～70岁。另选取伴有腹腔积液的肝硬化（Child-Pugh B 级18 例，Child-Pugh C 级10例）患者28例（其中酒精性肝硬化患者17例，肝炎肝硬化患者11例），男19例，女9例，年龄38～68岁。同时体检中心选28例健康人群（男16例，女12例，年龄38～66岁）作为对照组。所有腹腔积液患者中移动性浊音界于锁骨中线与腋中线的二度者占64.3%，移动性浊音超出锁骨中线的三度者占35.7%。排除标准：（1）患有除肝癌以外的其他肿瘤患者；（2）已知或可能怀孕者、哺乳期妇女；（3）严重心、肾功能异常，及有脑梗死、短暂性脑缺血发作及外周深静脉血栓形成者。

1.1.2 LPA测定方法 全部受验者均于清晨空腹采血取样2～4 mL，有腹腔积液的患者抽取腹腔积液10 mL。所有标本均于采集后30 min内3000 r/min离心10 min，仔细收集上清，采用酶联免疫法（ELISA）检测血清LPA 含量。LPA≥3.2 μmol/L 设为阳性，＜3.2 μmol/L 设为阴性。

1.2 体外试验主要仪器设备和试剂 CO2孵箱、蛋白电泳、实时定量PCR 及显影系统。DMDM 培养基、小牛血清（Gbico 公司）、LPA（MSK 公司）、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）（Sigma 公司）、结晶紫（Sigma-Aldrich 公司）、小鼠抗人β-actin、P53 抗体（北京中杉金桥）。鼠抗人FAK、RhoA 单克隆抗体购自Abcam 公司，辣根酶标记抗生物素IgG 抗体、Western Blot Luminol Reagent 和PVDF 膜均购自美 国SantaCruz 公司。DAB 显色试剂盒购自中杉公司。RNA 提取试剂及RT-qPCR 试剂盒购自大连宝生物（TaKaRa）公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 细胞培养 SMMC7721人肝癌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。细胞在DMDM 培养基（含10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，链霉素100 mg/L）中，5%CO2孵箱内37 ℃培养。待细胞生长到铺满细胞瓶底面80%左右进行细胞传代。

1.4 MTT 细胞增殖实验 按照5×103个细胞/孔将对数生长期细胞接种于96 孔板，培养至细胞80%融合后分组：空白对照组（只加无血清培养基）、LPA 组（含12.5、25、50 μmol/L LPA 的无血清培养基）、PTX 组（PTX 是LPA 拮抗剂，浓度为100 μg/L）、LPA+PTX 组（100 μg/L PTX和浓度为50 μmol/L的LPA）。

分别于加药后24、48 和72h，每孔加入15 μL MTT（5 g/L）继续培养4 h，再加入DMSO（150 μL/孔），振荡10 min后采用酶标仪（570 nm）测定吸光度（A）值。根据公式计算细胞生存率：细胞生存率=（实验组A值/空白组A值）×100%。每组设3个平行孔，实验重复3次。

1.5 细胞侵袭和迁移实验 取一无菌96孔培养细胞板，每孔加入约100 μL 的Matrigel 胶，置于4 ℃冰箱。约12 h后吸出上清液。用含5%血清的封闭液室温封闭约30 min。用移液器取1×105细胞接种于之前用Matrigel 胶包被的孔中分组实验，分组与细胞增殖实验相同。将细胞培养板置于恒温培养箱中继续培养24 h后用移液器轻轻吸出上层培养液。取100 μL含结晶紫溶液加入孔中，室温静置15 min染色。洗涤2次后静置培养板至其干燥。最后用移液器取100 μL 含5%SDS的乙醇滴入培养细胞的孔中，静置约30 min后，用酶标仪测定吸光值，并定量分析实验结果。

1.6 qPCR 检测相关基因的表达 取对数期生长的SMMC7721 肝癌细胞分组处理：LPA 组（终浓度为50 μmol/L），LPA+PTX 组（50 μmol/L LPA 和100 μg/L PTX），对照组（只加无血清培养基），继续培养至48 h，用Trizol 裂解细胞提取细胞总RNA，利用微量分光光度计检测A260/A280值评价提取RNA 质量与纯度，定量后各组取2 μg 总RNA 应用cDNA 合成试剂盒逆转录获得cDNA，用实时定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）检测RNA 表达水平，均按照试剂盒操作说明书操作。各基因的合成引物分别为：RhoA 上游引 物5'-TTCAGCAAAGACCAAAGATGGA-3'，下 游 引物5'-CACAAGACAAGGCACCCAGA-3'；p53 上游引物5'-GTGGTGGTGCCCTATGAG-3'；下 游 引 物 5'-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3'；FAK 上 游 引 物5'-GCCTGGTGAAAGCTGTCATC-3'；下 游 引 物 5'-GCTTCTGTGCCATCTCAATC-3'；GAPDH 上游引物5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3'，下 游 引 物5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'。对目的基因的表达进行相对定量分析。

1.7 Western Blot 检测相关蛋白的表达 取对数期生长的SMMC7721肝癌细胞分组处理，分组同RT-PCR实验，继续培养48 h，用PBS 洗1次，加4 ℃的裂解液（按1×107个细胞加入100 μL），超声粉碎细胞，低温离心后取上清液-80 ℃冻存。为确保蛋白上样量一致，样品中蛋白经Bradford定量，然后加入2×SDS凝胶加样缓冲液100 ℃煮沸变性，样品中蛋白通过12%SDS-PAGE 分离后转至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭4 ℃过夜；分别加入兔抗人P53，FAK，RhoA 和β-actin 抗体（1∶500），4 ℃过夜；用TBST 洗膜10 min，3次，加入1∶2 000 稀释的羊抗兔二抗，振摇1 h，TBST 洗膜，DAB 显色、拍照。分析系统测定各条带灰度值，计算蛋白表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。计量资料以xˉ±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组LPA 水平比较 （1）肝癌组血浆LPA 水平（4.99±0.55）μmol/L 明显高于肝硬化组（2.63±0.43）μmol/L 及对照组（1.61±0.39）μmol/L，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。肝硬化组与健康对照组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）肝硬化组2例腹腔积液LPA 值较高，但仍低于肝癌组LPA 水平。肝癌组腹腔积液LPA水平（5.19±0.63）μmol/L明显高于肝硬化组（2.91±0.46）μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 肝癌、肝硬化患者以及正常人群LPA的表达水平Table 1 Expression level of LPA in patients with liver cancer， liver cirrhosis and normal people

2.2 各组SMMC7721细胞增殖情况 对照组、（12.5、25、50 μmol/L）LPA 组、PTX 组 以 及LPA+PTX 组 的SMMC7721细胞24、48 和72 h 的增殖率具体如图1 所示。LPA 可明显促进SMMC7721 细胞增殖，细胞增殖率随剂量和时间增加而增加，尤其中高剂量组增殖率明显高于对照组，具有时间依赖性和剂量依赖性，随着给药剂量和时间的增加，增殖率逐渐增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而PTX 抑制其增殖能力，且具有时间依赖性，对照组和LPA 组细胞增殖率明显高于PTX 组，各组差异具有统计学意义（P＜0.05）。72 h高剂量LPA组的增殖率是对照组的3.6倍，PTX组是对照组的0.6倍，二者联合组是对照组的1.2倍。高剂量组LPA 联合PTX 组细胞增殖率有所增加，但和对照组无明显差异（P＞0.05）。说明LPA拮抗了PTX抑制细胞增殖的作用，这再次证明了LPA 有促进肿瘤细胞增殖的能力。

图1 各组SMMC7721细胞增殖情况Figure 1 The proliferation of SMMC7721 cells in each group

2.3 细胞侵袭和迁移实验结果 通过细胞侵袭和迁移实验检测了LPA 和PTX 对SMMC7721 肝癌细胞侵袭、迁移和黏附能力的影响（图2）。与对照组相比，加入LPA的SMMC7721细胞黏附能力明显增加，提示LPA能增加细胞黏附能力。LPA的拮抗剂PTX能明显降低SMMC7721细胞黏附能力，LPA可增加肝癌细胞的迁袭能力，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。但加用较高剂量LPA 和PTX 的联合组SMMC7721细胞的黏附能力与对照组比变化不明显。LPA能增加肝癌细胞黏附能力，PTX 作为LPA 的拮抗剂抑制肝癌细胞的黏附，抑制其迁移。结果表明随时间增加上述能力增加，各组差异具有统计学意义（P＜0.05）。72 h 高剂量LPA 的迁袭率是对照组的3.09倍，PTX 组是对照组的0.4倍，二者联合组是对照组的0.99倍。

图2 各组SMMC7721细胞侵袭、迁移和黏附能力Figure 2 Adhesion ability of SMMC7721 cells in each group

2.4 qPCR 结果 与对照组相比，50 μmol/L 的LPA 作用SMMC7721细胞48 h后，细胞P53基因mRNA相对表达量下降，而RhoA 和FAK 基因mRNA 表达量增加。LPA 组和对照组差异具有统计学意义（P＜0.05）。同时发现LPA+PTX 组的P53、RhoA 和FAK 基因表达与对照组比较无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图3 各组SMMC7721细胞P53、FAK、RhoA基因表达情况Figure 3 Expression of P53， FAK and RhoA genes in SMMC7721 cells

2.5 Western Blot 结果 同等内参β-actin 水平下，LPA 组SMMC7721细胞P53蛋白表达水平是对照组的20.9%，差异具有统计学意义（P＜0.01），LPA+PTX 组P53 蛋白表达水平有所升高，但仍低于对照组。LPA组SMMC7721 细胞的RhoA、FAK 蛋白表达水平是对照组的161.1%和153.9%，两组差异均具有统计学意义（P值均＜0.05），LPA+PTX 组RhoA、FAK 蛋白表达水平和对照组无明显差异。LPA能明显降低P53蛋白的表达水平，同时增加SMMC7721 细胞的RhoA 和FAK蛋白表达水平（图4）。

图4 各组SMMC7721细胞P53、FAK、RhoA蛋白表达情况Figure 4 Expression of P53， FAK and RhoA in SMMC7721 cells

3 讨论

LPA 最早是从卵巢癌患者的腹腔积液中分离纯化出的［5-6］，LPA 是血清中的正常成分，体液当中如血清、唾液和肿瘤患者腹水中都存在LPA。LPA 及其受体在一些肿瘤中的异常高表达表明LPA 在肿瘤发生、发展中起一定作用，LPA 可诱导多种细胞增殖，可增加肿瘤细胞浸润，参与肿瘤的发生发展［7］。LPA 作为一种多功能的生物活性磷脂分子，能够参与调控细胞迁移、增殖、分化和凋亡等生物学行为［8］。

本研究通过ELISA 检测发现肝癌患者血浆中LPA 水平明显高于肝硬化患者和正常人群，而且肝癌患者腹腔积液中的LPA 水平明显高于肝硬化患者腹腔积液中的表达水平，差异均具有统计学意义。上述结果与既往研究结果一致，再次证明了LPA 在肝癌患者中有异常高表达，可作为肝癌肿瘤预测因子和治疗靶点［9］。

肿瘤细胞中有广泛的LPAR1表达，并且能够通过激活MAPK、Akt和Rho信号通路等方式调节细胞的增殖和迁移［10］，同时LPAR1 能够下调肿瘤抑制因子p53的表达情况［11］。LPAR2 可通过激活Rho、Ras、Rac、MAPK、PLC 和PI3K 等信号通路来调节细胞的迁移和增殖。LPA能够通过与其紧密连接的受体激活下游多条信号通路，其中RhoA/ROCK信号通路在LPA信号传导中发挥着至关重要的作用。有研究［12］报道野生型的p53基因可以促进肿瘤细胞凋亡，但突变的p53基因可能通过激活RhoA 的这条途径，参与肿瘤细胞生长、增殖及凋亡等生物学行为的调控。FAK是一种位于胞质内的酪氨酸激酶，FAK 涉及到细胞的黏附、播散、迁移和凋亡表达，有研究［13］显示在多种肿瘤中有FAK的过度表达，包括起源于肝脏、直肠、肺部等肿瘤。FAK可能在肝癌相关通路调控着肿瘤细胞的存活、增殖，介导肝癌细胞与其他促进细胞迁移细胞因子如RhoA 的相互作用过程。FAK 会调控RhoA 的激活，RhoA 可以介导FAK的磷酸化作用，激活细胞迁移信号通路［14-17］。既往研究［18-19］显示肝癌细胞中RhoA 蛋白的表达量明显高于正常肝细胞。基于上述论点，本文研究了LPA对肝癌细胞中RhoA、FAK 和野生型P53基因和蛋白的影响，进一步明确LPA 的作用机制。本研究通过RTqPCR 和Western Blot 实验证明经LPA 处理的肝癌细胞中RhoA、FAK基因和蛋白表达明显增加，同时，LPA可以抑制野生型P53 基因和蛋白的表达，与既往研究［20］结果一致。

PTX 对LPA 有较明显的阻断效应，PTX 能拮抗LPA 对上述基因和蛋白的作用。本研究通过MTT 细胞增殖试验、细胞黏附实验检测发现，加用LPA 抑制剂PTX 后细胞增殖和黏附能力明显下降，且明显低于对照组。LPA 和PTX 互相拮抗，LPA 对细胞增殖和黏附、迁移能力有明显的促进作用，提示LPA 能促进肝癌细胞增殖和黏附、迁移作用，从而诱发肝癌的发生和发展。

伦理学声明：本研究方案于2021 年经由吉林省一汽总医院伦理委员会审批，批号：SB-2021-014。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：赵燕颖负责撰写文章；邹艳平、李云鹏、徐涛、刘丽艳参与了实验数据的整理和数据统计分析；程海涛指导文章撰写过程；韩振琦负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。