曹施静，胡海霞，楠 极

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古 包头 014109）

0 引言

食醋采用多菌种混合发酵工艺，由众多微生物发酵而形成的一种酸味调味剂。食醋酿造主要包括固态和半固态工艺，微生物在开放式环境下经过各种作用机制及相互作用从而酿造出食醋[1-2]。食醋生产原料种类丰富，主要包括高粱、大米、小米、麸皮、小麦等，不同的原料所呈现的食醋品质有所不同。在我国，传统食醋主要以“四大名醋”而闻名。山西老陈醋，以谷物为主要原料，酒化完成后再经醋酸发酵等工序酿制而成；四川保宁醋，其主要原料为麸皮，辅料为小麦、玉米和大米，通过生料固态发酵的方式在低温条件下酿造而成；镇江香醋，其主要原料为优质糯米，通过固态发酵技术发酵而成；福建永春老醋，其主要经过多次添加糯米等原料，通过液体发酵方式并经过3 年以上陈酿而成。

山西陈醋作为四大名醋之一，被誉为国家地理标志产品，富含丰富的氨基酸等营养成分，具有软化血管等独特功效；四川保宁醋，具有促进钙、铁吸收、降脂减肥、预防动脉硬化和美容养颜等功能性作用；镇江香醋，具有降血压、血脂、分解乳酸、抗菌发等功效；福建永春老醋含有多重营养成分和有益微生物，经常食用福建永春老醋能增进食欲、开健脾胃，对治疗皮肤病、动脉硬化、高血压等有重要功效。

近年来，国内外有关传统四大名醋发酵过程中的功能微生物及作用机制剖析越来越深入，对酿造过程中的微生物菌种及发酵作用机理的深入剖析，将有利于开辟新的市场，满足食醋市场需求。在传统四大名醋研究中也存在着一些难题，由于大多数微生物在环境中难以培养，单纯依靠传统的分离培养方法对发酵过程中的功能微生物组成及丰度变化很难测定。目前，大多数研究多采用分子生物鉴定及基因测序等方式对发酵过程中的微生物结构组成等进行研究，为食醋研究提供一定的理论指导和现实意义。

1 发酵微生物种类

1.1 霉菌

霉菌主要产生于淀粉糖化阶段，在此过程中，糖在淀粉前期作用下形成，氨基酸在蛋白质前期作用下形成。除此之外，在发酵过程中还会产生蛋白酶，对原料中产生的各种氨基酸和多肽具有分解作用，蛋白酶的含量是衡量食醋品质优劣的一个标准。王佳丽等人[3]从山西老陈醋大曲样品中筛选鉴定出75 株霉菌，经过测序发现，黑曲霉和米曲霉在大曲中占据主要地位。王龙[4]通过菌种分离法从山西老陈醋中分离筛选到2 株高产酶的霉菌菌株（M3，M8），经过鉴定M3 菌株为犁头霉属，M8 菌株为曲霉属。

1.2 酵母菌

酵母菌主要产生于酒精发酵阶段，在发酵过程中为其他菌种提供营养物质，提升食醋的风味和醋体品质。酵母菌由于在发酵过程中处于无氧环境，在酶的作用下，把糖最终转换成乙醇和CO2，最终以醋酸的形式呈现出来，该过程提供了一个基于代谢产物呈递的简单相互作用。范三红等人[5]对山西陈醋微生物群落进行测序发现伊萨酵母菌属在整个发酵过程中都处于优势地位。Zhang Qi 等人[6]通过分离法从山西老陈醋大曲中纯化筛选出了一株酵母菌（Y14）。经过基因测序和生化鉴定，大曲酵母Y14 为产酯能力最高的东北毕赤酵母（Pichia manshurica）。

1.3 乳酸菌

乳酸菌主要产生在醋酸发酵阶段，其产生的有机酸类赋予食醋特殊的风味物质。乳酸菌中富含不挥发性酸，在食醋发酵过程中，乳酸菌产生的相关产物具有防腐杀菌、缓解食醋刺激口感和改善食醋品质的作用。此外，乳酸菌在风味香气方面也发挥着重要作用，其代谢产生的酶系能将蛋白质转化分解为氨基酸[7]。杜宏福等人[8]对山西老陈醋酒精及醋酸发酵微生物构成与有机酸变化关系进行研究，结果表明，在酒精发酵阶段，乳酸菌产量及其多样性呈上升趋势。邢晓莹等人[9]从山西老陈醋中筛选得出54 株乳酸菌，经过进一步的产酸能力分析，发现其产酸可达（9.56±0.23） g/L，同时具有耐高温的性能。张雅琳等人[10]对四川麸醋发酵中的细菌微生物构成和变化规律进行基因测序分析，结果表明在细菌微生物组成中，主要优势细菌为耐酸乳杆菌和巴氏醋杆菌。

1.4 醋酸菌

醋酸菌作为醋酸发酵的一类重要的微生物，在发酵过程中发挥着重要作用，能将乙醇氧化成乙酸，影响食醋的品质与口感[11-12]。在食醋发酵过程中，醋酸菌产酸能力的大小与工艺生产有着直接关系，筛选性能优良的醋酸菌对提高企业生产效率发挥重要影响。王梦颖等人[13]对山西老陈醋细菌组成和微生物相对丰度通过基因测序技术进行分析，表明在整个发酵过程中，乳杆菌属、醋酸杆菌属及Faecalibacterium 在细菌种类中占有绝对比例。华青松等人[14]从镇江香醋前期筛选出来的醋酸菌中分离得到 2 株耐高温及产酸能力强的醋酸菌，并且将其命名为菌株AABA，AABC，经过16S rDNA 基因鉴定，菌株AABA，AABC 都是巴氏醋酸杆菌属。此外，醋酸菌AABA 生长状态在37 ℃最好，醋酸菌AABC 生长状态在40 ℃最好。在产酸能力方面，醋酸菌AABA 为45.5 g/L，醋酸菌AABC 为28 g/L。

在食醋整个生产中，主要功能微生物是霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌，霉菌在食醋初期发酵过程中能将淀粉转化为糖类物种，为微生物提供一定的营养物质，为酒精发酵提供良好的前提；酵母菌能将糖类物质转化为遗传，提供发酵动力；乳酸菌中的有机酸类能赋予食醋良好的口感及品质；醋酸菌能将乙醇氧化为醋酸，正是通过这些发酵的微生物的协同作用，最终呈现出来风味多样的食醋[15-17]。

2 四大名醋发酵为微生物研究

2.1 Alpha 多样性指数

在已有多样性指数内容研究中，Shannon、Simpson 代表着多样性，Chao1 和ACE 代表丰富度。其中Shannon 和Simpson 指数代表物种分布多样性和均匀度情况，分布越均匀表示多样性也就越高，相应指数变化也就越大；Chao1 和ACE 指数表示物种总数，物种总数越大表示丰富度越高，相应指数变化也就越大。程荷芳[18]高通量测序技术对四川麸醋发酵过程中的菌种多样性进行测序分析。研究表明，在发酵初期最高的是Shannon 和ACE 指数，但在发酵过程中多样性和丰富度指数开始逐渐下降，在末期又呈上升趋势，在整个醋酸发酵过程中，乳杆菌属和醋杆菌属处于优势地位。寇容等人[19]利用测序技术分析山西陈醋不同发酵时段醋醅样品的微生物多样性及组成情况。研究发现，细菌群落微生物分布比真菌群落分布均匀，在Shannon 和Simpson 多样性指数也就越大；在Chao1 和ACE 丰富度指数方面，细菌群落也高于真菌群落，根据其上结论得出细菌群落比真菌群落更具有丰富性。

2.2 微生物多样性曲线

样品稀释曲线用来评价测序量是否可以占据所有微生物菌群，并间接反映物种的丰富度，也可表示取样是否适量。Shannon-Wiener 曲线可以根据在不同测序深度的各样品测序量来构建微生物多样性指数曲线，反映各样品在不同测序量多样性变化。李雅茹[20]通过测序技术对山西陈醋醅微生物多样性及组成情况进行研究。分析发现，在多样性及丰富度变化情况中，细菌大于真菌；此外，大曲中的优势细菌和真菌属分别为乳酸杆菌属和覆膜孢酵母属。Zhu Yunping 等人[21]通过高通量测序和代谢组学的方法对山西老陈醋微生物细菌演替和风味形成进行探究。研究表明，早期优势细菌为泛菌、片球菌、乳球菌和根瘤菌；中期优势细菌为乳酸菌（67.72%）；后期优势细菌为醋酸杆菌、小马杆菌和克氏杆菌。孟燕华[22]利用高通量测序技术对醋醅样品中的微生物多样性进行分析，结果表明，乳杆菌属和醋杆菌属属于优势菌属。此外，乳杆菌属的丰富度大于醋杆菌属，在发酵过程中占据主要优势。崔宁波[23]对食醋原料及大曲样品利用高通量进行测定分析，结果表明，酿酒酵母在原料中为优势真菌，相对丰富占比为99.73%；黑曲霉在大曲为优势菌种，相对丰度占比为98.86%。

2.3 物种分布情况

按照分类学分析结果，可将群落组成分为门、纲、目、科、属、种这几大类。王俊奇等人[24]通过高通量测序和分子标记对永春老醋醋酸发酵过程中醋醅、成品醋和不同陈酿时期细菌、真菌多样性演替规律进行分析，结果发现，成品醋和1 年陈酿在纲水平上，α - 变形菌纲和芽孢杆菌纲是占有很大比例；在属水平上，具有绝对优势的是醋酸杆菌属和乳杆菌，细菌群落在10 年陈酿中没有检测到；在真菌多样性动态变化研究中，酵母纲和散囊菌纲在4个不同发酵阶段的样品中都具有一定比例。Nie Zhiqiang 等人[25]对山西老陈醋大曲中的细菌和真菌结构借助PCR-DGGE 测序技术进行研究，结果显示，在大曲的发酵过程中覆膜孢酵母属、曲霉菌属、毕赤酵母属、红曲霉等为主要优势真菌。

3 发酵微生物关联作用研究

传统食醋在发酵过程中由于环境开放性、菌种结构的复杂性，导致发酵过程由多个微生物菌种通过相互作用形成，由于这些作用机制的存在，最终呈现了各种交互作用关系，从而影响了群落的结构组成及功能。在互利共生关系中，微生物菌种相互受益；在偏利共生关系中，一种微生物菌种受益，而另一种微生物不受影响；竞争关系指微生物菌种通过抢夺营养物质及限制多种生长因子而获得优势地位的现象；寄生是指通过消耗另一种微生物而使自身收益的关系；中立是指2 种微生物自身代谢能力的差距，从而导致生长互不干涉的现象。

寇蓉[26]对镇江香醋酿造过程中分离的优势细菌属的相互作用通过原位模拟培养和异位培养方法进行分析，研究发现在醋醅中乳酸杆菌和醋酸杆菌可以同时稳定存在，但在发酵条件的改变下，不同种类的乳酸杆菌和醋酸杆菌其共现关系也随着变动。有研究对山西老陈醋酿造过程中主要乳酸杆菌（Lactobacillus（L） . helveticus CGMCC 1.1877） 和醋酸杆菌（Acetobacter (A). pasteurianus CP-A11） 的相互作用通过原位模拟共培养方法进行了深入剖析，研究发现，共培养对乳酸杆菌有抑制作用，而对醋酸杆菌有促进作用。目前，微生物作用机理在食醋酿造过程中对微生物动态变化和生长代谢起着关键作用，将不同的优良菌株应用于不同发酵过程，对食醋品质和稳定性具有重要影响，该研究将对食醋酿造具有重要的理论价值和现实意义。

4 高通量测序技术的应用

该测序技术能同时对数量非常多的基因分子片段进行测定。在保持高精准度的同时，降低了检验成本并提升了测定速度。如今在传统发酵食品中被广泛应用，为传统发酵食品开发研究提供了现实指导和参考。通常来说，发酵食品主要通过微生物在发酵过程中的转化作用而形成。由于开放式的环境，使微生物组成丰富多样[27]，对发酵体系的研究必须以代谢机制研究为前提[28]。伴随基因测序及高通量测序技术的广泛应用，研究发酵食品中的微生物组成及结构等内容将在食品研究领域中成为主流趋势[29-31]，将对食醋行业发展起着重要推动作用。

4.1 PCR-DGGE 技术

该技术主要针对微生物多样性和微生物群落进行分析。在酒曲、泡菜、乳制品等发酵食品中已被广泛应用[32-34]，与其他高通量测序方法相比，该方法能直接提取DNA，具有分析速度快、能反映整个微生物群落等优点。Wei Xu 等人[35]通过该技术对镇江香醋的发酵微生物动态变化趋势进行分析。数据显示，在发酵过程中主要以醋酸杆菌属、乳酸杆菌属等为主要细菌，以酵母菌属为主要真菌。Li Pan 等人[36]对山西老陈醋细菌群落组成进行测序分析，研究发现乳杆菌和醋杆菌属在醋酸发酵时期中具有较高占比。此外，欧文氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等在发酵过程中也占有一定比例。

4.2 RT-FQPCR 技术

RT-FQPCR 是对DNA 或RNA 序列进行实时扩增和检测特定的测序技术。该测序技术利用荧光染料或探针，当与扩增的DNA 或RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。夏梦雷等人[37]对镇江香醋醋酸发酵过程中菌种动态变化利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-FQPCR） 测序技术进行分析发现，酵母菌、乳酸菌及醋酸菌为醋醅中的优势微生物，三者超过80%在真菌、细菌总占比中。

4.3 宏基因组技术

宏基因组测序是将样品中的DNA 进行扩增、纯化、片段化、连接到适当的适配器上，利用此技术进行测序。该技术针对测定的样品基因，通常从样品中直接提取，从而分析微生物之间的多样性、种群结构、功能信息、与环境之间的关系，近年来在微生物学研究中得到了广泛应用。刘爱平等人[38]对四川麸醋醅发酵过程中的菌种组成通过宏基因组测序进行研究。分析发现，金山乳杆菌、巴氏醋杆菌等在微生物种类中占据优势比例，且这些优势菌种同属70 个门、885 个属和3 168 个种。Wang Zongmin等人[39]对镇江香醋宏基因组学和偏好分析，数据显示，醋酸菌属和乳酸菌属在细菌中占有绝对优势，曲霉属和链格孢属在真菌中占有绝大比例。

4.4 宏转录组学技术

宏转录组学是在转录水平，以特定样本中微生物群落的全部转录本为研究对象，分析微生物群落的基因表达与调控。该技术没有微生物的分离培养，为研究人员提供了研究的特定环境、特定时期微生物群落基因组转录情况以及转录调控规律的高效工具。Wu Yanfang 等人[40]通过宏转录组学对山西老陈醋中有机酸的代谢机制进行研究发现，乙酸、乳酸代谢来源与乳酸杆菌属和醋酸杆菌属有着直接关联，而影响微生物代谢活性的环境因子主要是温度、乙酸。

4.5 几种测序方法优缺点比较

针对几种测序方法优缺点进行了概括，如鉴定微生物的群落种类，PCR-DGGE 和RT-FQPCR 测序技术更适用，若对深入的生物学功能进行研究，宏基因组相关测序技术更适用。目前，随着测序技术的不断发展，检测成本的减少，宏基因组有关的测序技术将会被广泛应用，成为研究的主要趋势。

测序方法优缺点比较见表1。

表1 测序方法优缺点比较

5 结语

综上所述，发酵微生物在食醋的整个酿造过程起着关键作用，对食醋的出醋率及醋体品质有着重要影响，因此探索食醋发酵微生物的结构组成及发酵机理对控制食醋品质十分必要。目前，对传统四大名醋的研究大多集中在微生物的组成剖析、菌种的分离筛选等方面，对发酵微生物背后的作用机制以及酿造机理的相关研究还较少，相信随着人们对食醋研究的不断深入、检测方法的不断发展完善，对四大名醋的发酵微生物研究内容将进一步扩展深入，为食醋企业生产提供理论依据和现实指导。