施 树，罗 章

（1.重庆旅游职业学院，重庆 409000；2.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000）

传统自然发酵蔬菜的制作已有数千年的历史[1]，是我国劳动人民为了延长蔬菜贮藏期，不断在实践中摸索出的制作加工技术和经验的结晶。发酵蔬菜所用的原料和发酵方法各地略有不同，但其制作的原理都是利用微生物的发酵作用，使蔬菜得以贮藏的同时，也赋予其脆嫩酸爽的口感和风味。

1 传统自然发酵蔬菜的制作方法

传统自然发酵蔬菜的制作方法大致可以分为固态发酵法和液态发酵法。固态发酵一般的做法是：以广口的缸作为器具，剔除菜根、损伤、腐烂、萎蔫、有病虫害的部分，将蔬菜清洗干净，分切或不分切，放入清洗干净的缸中，每放一层蔬菜，在其表面均匀撒适量的盐，最后用石头将蔬菜压紧，用塑料膜封住缸口发酵。例如，北方酸菜、酸豇豆等。液态发酵即泡制法，用专门的泡菜坛子作为器具，将蔬菜没入其中浸泡发酵。可泡制的蔬菜诸多，如芹菜、萝卜、豇豆、辣椒、黄瓜等。一般的做法是：剔除菜根部、损伤、腐烂、萎蔫、有病虫害的部分，清洗干净，分切或不分切。泡菜坛子清洗干净，倒入含一定浓度食盐的凉开水，将蔬菜浸泡其中。也可往其中加入适量老泡菜水和一些辣椒、姜、蒜、花椒、白酒、白砂糖等辅料。盖上盖子，坛口边缘撒盐，水封发酵，如四川湖南等地的泡菜。

2 传统自然发酵蔬菜中的微生物

传统自然发酵蔬菜是混菌发酵的产物，其中的微生物种类繁多。张璐璐[2]分析采集于广西、四川和贵州的酸菜中的微生物显示，主要有乳杆菌属（Lactobacillus），片球菌属（Pediococcus），明串珠菌属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella） 和乳球菌属（Lactococcus），优势菌种为耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）。孟霞等人[3]对发酵过程中青菜泡菜样品中真菌的多样性进行研究表明，发酵中期优势菌是德巴利酵母属（Debaryomyces），在发酵第15 天毕赤酵母属（Pichia） 为绝对优势菌，发酵第81 天奥默儿玉氏酵母（Kodamaea ohmeri） 为绝对优势菌。Zhou Q 等人[4]研究了东北酸菜中细菌群落的动态变化：乳酸杆菌、明串珠菌属和肠杆菌是自然发酵酸菜不同发酵期的主要微生物。Xiao Y S 等人[5]分析泡菜发酵过程中微生物多样性，共鉴定出90 种细菌和135 种真菌，发酵起始主要是环境微生物（如微球菌科），然后是以明串珠菌科为主的异型乳酸发酵阶段，最后是以乳酸杆菌科为主的同型乳酸发酵阶段。朱琳等人[6]对萝卜泡菜发酵液中细菌多样性进行研究显示，优势菌属依次分别是明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、魏斯氏菌属（Weissella） 和片球菌属（Pediococcus） 等。韩俊燕等人[7]对发酵辣椒中的微生物分析显示，剁辣椒中主要的菌属是魏斯氏菌、明串珠菌和乳杆菌，乳杆菌（61.5%） 和片球菌（28.6%） 是酸辣椒中主要的细菌，腌辣椒中乳杆菌的丰度达到79.4%，辣椒酱中主要的微生物魏斯氏菌（40.7%） 和乳杆菌（11%）。刘长根[8]对传统发酵蔬菜的乳酸菌多样性进行分析显示，泡菜中乳酸杆菌属、魏斯氏菌属及片球菌属是主要菌属，植物乳杆菌和短乳杆菌是主要菌种，北方酸菜中主要菌属是乳酸杆菌属、片球菌属及魏斯氏菌属，主要菌种是植物乳杆菌、短乳杆菌、棒状亚乳杆菌及小片球菌，辣白菜中乳酸菌属主要为乳酸菌杆菌属、片球菌属、明串珠菌属及魏斯氏菌属，主要乳酸菌种为植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、清酒乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌及乳酸杆菌亚种。颜娜等人[9]对恩施地区酸萝卜中细菌多样性进行研究发现，优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus），平均相对含量是55.76%。向凡舒等人[10]对建始地区泡酸豇豆水中细菌多样性研究发现，主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus） 及明串珠菌属（Leuconostoc），乳酸杆菌是泡酸豇豆水中的优势菌，主要以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 为主。郭倩倩等人[11]对晴隆酸菜中微生物进行动态分析，总发酵过程中优势菌属为5 个细菌属，9 个真菌属，发酵末期主要优势细菌属依次分别是魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）。Yang X Z 等人[12]对取自3 个不同家庭自然发酵的东北酸菜分析表明，厚壁菌门和变形菌门是优势门，魏斯氏菌属是所有样本中最丰富的属，1 号酸菜中发现较多的梭状芽胞杆菌，2 号酸菜中发现较多的梭菌和肠杆菌，3 号酸菜中乳酸杆菌的相对丰度较高。任亭等人[13]研究了涪陵泡青菜头细菌的多样性显示，在发酵的前期有假单胞菌（Pseudomonadaceae）、肠杆菌（Enterobacteriaceae） 及欧文氏菌（Erwinia） 等变形菌门菌群存在，后期优势菌属是片球菌属（Pediococcus）。

3 益生菌及筛选

联合国粮农组织与世卫组织（FAO/WHO） 联合工作组定义益生菌为“当给予合适数量的活的菌时，会给宿主带来健康益处”[14]。由此可以看出，作为益生菌应满足5 个条件：①活的菌；②合适的数量；③对人体是安全的；④在人体内能够存活并定殖；⑤对人体健康具有一定的功效。目前，已研究的具有益生功能的菌主要是一些乳酸菌、非乳酸菌类的细菌和酵母[15]。乳酸菌不是一个系统分类学上的概念，是指发酵糖类物质主要生成的产物是乳酸的一类细菌的总称[16]。

可用于保健食品中的益生菌见表1[17]。

表1 可用于保健食品中的益生菌

传统自然发酵蔬菜制品中主要优势菌群是乳酸菌，是经过人们长期食用历史所验证安全的。以此为来源，分离筛选具有益生功能的乳酸菌、研制有益于人体健康的益生菌制品是研究的热点之一。

一般采用改良后的MRS 培养基来分离乳酸菌，在MRS 琼脂培养基中加入2%左右的碳酸钙[18-20]，或者添加一定量的溴甲酚绿[21]，然后采用平板划线法纯化。对纯化后的菌株进行革兰氏染色，保留革兰氏阳性菌再对其做过氧化氢试验，筛选过氧化氢试验阴性的菌株初步判定为乳酸菌，对其进行纯化后保存备用[25]。益生性乳酸菌的筛选主要是考虑其安全性、耐酸、耐胆汁、黏附能力、对条件致病菌的拮抗活性、发酵能力和益生功能[23]。

4 传统自然发酵蔬菜源益生菌的抗氧化性能

活性氧（Reactive oxygen species，ROS） 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS） 是好氧生物正常的代谢产物[24]。适当水平的ROS/RNS 对于入侵微生物的免疫反应和调节细胞间通讯起着关键作用[25]。机体在正常情况下，氧化物水平是处于动态的平衡状态。当机体细胞内促氧化成分与机体内抗氧化成分之间的平衡被打破，向着有利于氧化物积累的方向转变被称为“氧化应激”[26]。此时，过量的氧化物会与体内的酶、蛋白质及核酸等物质发生一系列反应，导致如动脉粥样硬化、高血压、缺血、溢血、糖尿病、急性呼吸窘迫综合征、病理性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、哮喘、神经系统疾病和癌症等疾病的发生[27]，有必要通过摄入外源抗氧化剂来减少氧化应激。益生菌被确立为膳食辅助剂，具有多种有益特性，似乎部分与其抗氧化特性有关。找到潜在的具有抗氧化特性及对人体健康有益的益生菌菌株，已经成为人们研究的兴趣所在。体外和体内研究表明，益生菌表现出抗氧化潜力。单独食用益生菌或补充益生菌的食物可以减少氧化损伤[28]。益生菌抗氧化活性的潜在机制可能是通过清除ROS、螯合金属离子、增加抗氧化酶水平和调节微生物群来发挥抗氧化作用[29]。

白明等人[30]比较乳杆菌、乳酸乳球菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的抗氧化活性显示，乳酸乳球菌清除自由基的能力最强，嗜热链球菌次之，而乳杆菌和双歧杆菌对自由基的清除能力最弱，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 对益生菌的抗氧化起主要作用，谷胱甘肽（Glutathione，GSH） 的存在因种属和菌株的不同而差别较大，总巯基化合物（Total thiol groups，TTG） 对益生菌的抗氧化起了积极作用。Amaretti A 等人[31]对34 株乳酸菌（7 株双歧杆菌、11 株乳酸杆菌、6 株乳球菌和10 株嗜热链球菌） 进行体外抗氧化活性测定表明，当剂量至少为108CFU/d 时，抗氧化剂混合物有效地减少了阿霉素诱导的氧化应激，这些益生菌菌株可能有助于预防和控制与氧化应激相关的疾病。Paulina K 等人[32]研究了益生菌干酪乳杆菌与益生菊粉对人体血浆的抗氧化能力，结果显示，含有干酪乳杆菌（4×108CFU）与益生菊粉（400 mg） 可对人血浆抗氧化能力和所选抗氧化酶的活性产生积极影响。Jang H J 等人[33]研究表明，从泡菜中分离出活的或热杀死的植物乳杆菌Ln1 可能作为有用的抗氧化剂益生菌。Javad H 等人[34]对医学文献数据分析，表明益生菌和合生素补充可以提高抗氧化能力，增加体内抗氧化酶的数量。卢佳音[35]从东北传统自然发酵酸菜筛选出5 株乳酸菌，具有不同的抗氧化能力，完整细胞悬液的羟自由基清除能力、DPPH（1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼） 自由基清除能力、还原力均高于无细胞提取物。Yang S J 等人[36]评估了从泡菜中分离的植物乳杆菌200655 的抗氧化作用，其在DPPH 和ABTS（2,2,-联氮- 双-3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸） 自由基清除和β - 胡萝卜素漂白试验中显示出最高的抗氧化效果。王晶晶[37]对传统自然发酵剁椒抗氧化规律进行了研究，在整个发酵过程中，剁辣椒呈现出较佳的抗氧化能力，发酵前9 d 其对DPPH 自由基清除的能力呈增强的趋势最为明显，发酵第9 天后上升趋势趋于平缓。罗潇[38]研究显示，传统发酵蔬菜的抗氧化能力随着发酵时间逐步增强，SOD 活性、还原力、DPPH 自由基清除率均在第7 天达到最大值。夏海燕等人[39]从酢辣椒筛选出短乳杆菌和发酵乳杆菌，发现其抗氧化能力较强。黄承敏[40]从自然发酵剁辣椒中分离得到植物乳杆菌Y-20，研究其所产胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS） 的体外抗氧化活性，结果表明EPS 对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子均具有清除功能。Zer C 等人[41]研究了韩国泡菜（Kimchi，KM）、德国酸菜（Sauerkraut，SK） 和酸大白菜（Pickled cabbage，PC） 的抗氧化性能，KM、SK 和PC 的80%乙醇提取物具有较高的DPPH 清除活性。孙宁等人[42]从自然发酵酸笋中筛选出4 株短乳杆菌和2 株消化乳杆菌，对DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率、还原能力均比较强，这6 株乳酸菌具备优良的益生性能和体外抗氧化活性。Kim K T 等人[43]研究评估乳酸菌菌株的益生菌特性和抗氧化活性，从泡菜中分离的短乳杆菌KU15147 的抗氧化活性高于其他测试菌株，其诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子- α 的相对表达强度高于其他菌株，表明该菌株可以作为一种新型益生菌菌株应用于保健食品或制药行业。解文利[44]对从贵州、吉林两地具有代表性的发酵蔬菜中分离到的乳酸菌菌株进行体外抗氧化活性评估，贵州组乳酸菌对ABTS 自由基清除、DPPH 自由基清除、抗脂质过氧化能力整体高于吉林组。胡蝶等人[45]从泡菜汁中分离得到清酒乳杆菌、肠膜明串珠菌和弯曲乳杆菌，弯曲乳杆菌的还原能力都优于另外两株菌，肠膜明串珠菌的DPPH清除能力最强。解文利等人[46]从泡菜中分离出的6 株植物乳杆菌，对其体外抗氧化活性研究表明，在6 株植物乳杆菌对ABTS 和DPPH 自由基清除作用中，发酵上清液组的清除率均高于完整细胞组和无细胞提取物组。Kim S 等人[47]研究了来自15 种食品中细菌菌株的无细胞上清液（Cell-free supernatant，CFS）的抗氧化活性，结果表明乳酸菌通过清除DPPH 和ABTS 自由基来缓解氧化应激，抑制了NO 的产生，并降低了脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS） 活化RAW264.7 细胞中诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS） 和环氧化酶（Cyclooxygenase 2，COX-2） 的水平，试验菌具有被用作益生菌和抗氧化功能食品的强大潜力。

5 结语

诸多研究显示益生菌具有抗氧化特性，对改善氧化应激、减少机体被氧化、防止疾病和延缓衰老、保持机体健康具有重要意义。传统自然发酵蔬菜制品已经被人们长期食用，安全性得以保证。这些发酵制品中含有大量的各种潜在的益生功能微生物。从中筛选具有发酵能力强，适应胃肠道环境，能在肠道中定殖，具有良好益生功能和抗氧化特性的微生物作为益生菌，开发对健康有益的益生菌食品或者药品，改善人体健康具有重要意义。