滕迎弟，王解语，唐业豪，黄莉莉，*巫永华，2，张建萍，2，刘恩岐，2

（1. 徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018；2. 徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum） 是茯砖茶加工过程中的优势菌，大量繁殖后会形成一种金黄色闭囊壳结构，俗称“金花”，也因此称其为金花菌[1]，该菌的自身代谢产物无毒害作用，具有抑制肿瘤细胞增长、降血脂等生理功能[2]。大量研究表明，接种冠突散囊菌固态发酵会对其活性成分、功能特性和风味产生影响。Xiao Y 等人[3]探讨了冠突散囊菌对秋季绿茶品质提升的作用机制。Zou M M等人[4]研究了用冠突散囊菌固态发酵银杏籽粉，表明发酵银杏籽粉的抗氧化活性明显增强，银杏酸含量降低44.97%。此外，发酵银杏籽粉表现出更好的消化率，并具有令人愉悦的类似橙子的气味。杜静等人[5]研究表明，经冠突散囊菌固态发酵后的葛根，部分活性成分的含量提高，且发酵后产物具有一定的抗氧化活性，不良的中药味得到改善。

牛蒡（Arctium lappa L.） 为菊科牛蒡属两年生草本植物，是中国传统药食同源的植物[6]，由于其含有牛蒡菊糖、多酚、黄酮、木脂素、氨基酸和矿物质等有益成分而被开发成牛蒡茶等产品。传统上，牛蒡茶的加工包括切片、烘烤等工序[7]，制作工艺较为简单，所得牛蒡茶口感苦涩，产品口感和风味不易被消费者接受；在牛蒡茶品质改善上，于沛沛等人[8]报道了接种黑曲霉渥堆发酵制备牛蒡茶的工艺。徐艳平[9]优化了灵芝发酵牛蒡茶的工艺，研究表明冠突散囊菌是影响茯砖茶品质的关键因素，对于形成茯砖茶菌香浓郁、汤色红浓、口感醇厚的独特特征和风味具有重要作用[10]。通过接种冠突散囊菌，利用“散茶发花”[11]技术改善牛蒡茶的品质，为牛蒡发酵茶的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡，购自农贸市场；冠突散囊菌（Eurotium cri-statum），北纳创联生物科技有限公司提供；福林酚、没食子酸、芦丁、熊果酸、葡萄糖，上海叶源生物科技公司提供；苯酚、甲醇、浓硫酸、三氯化铝，均为分析纯，国药集团上海试剂公司提供。

1.2 仪器与设备

DFY-200C 型高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品；HH.B11.500S 型电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司产品；YXQ-LS-18SI 型手提式高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2F 型超净工作台、BGZ-76 型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司产品；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 制作流程

（1） 工艺流程。新鲜牛蒡→挑选、清洗→切片→0.1%柠檬酸浸泡护色→干制→高温灭菌→接种冠突散囊菌→恒温恒湿固态发酵→干燥→成品。

（2） 操作要点。取一定量的干燥牛蒡切片于250 mL烧杯中，添加一定的纯水，无菌封口膜密封后，高压蒸汽灭菌锅灭菌15 min，放置已灭菌的无菌操作台中冷却至室温，接种一定量的冠突散囊菌孢子悬液，于温度28 ℃，湿度80%的恒温恒湿箱中发酵，发酵完后干燥至水分含量小于10%，制成发酵牛蒡茶。

1.3.2 冠突散囊菌孢子悬液的制备

将装有菌种的安瓿管表面消毒后在安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎，之后吸取0.5 mL 无菌水打入冻干管，充分溶解菌粉后，用移液枪吸取200 μL 于准备好的平板中，涂布均匀，将平板置入28 ℃培养箱中培养7 d，待长出金黄色菌落后，用接种环将金黄色闭囊壳刮下，并置于装有100 mL 无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，振荡均匀后，将其稀释为浓度1×108个/ mL 的孢子悬液。

1.3.3 冠突散囊菌发酵牛蒡茶的工艺优化

（1） 基质含水量对牛蒡发酵效果的影响。设置牛蒡片初始水分含量分别为15%，20%，25%，30%，35%，接种10%（接种量为接种菌悬液体积与牛蒡质量比） 的冠突散囊菌孢子悬液，用无菌透气封口膜封口，于温度28 ℃，湿度80%的恒温恒湿箱中发酵7 d，通过感官评分确定最佳初始水分含量。

（2） 接种量对牛蒡发酵效果的影响。取一定质量的牛蒡片，加无菌水至初始水分含量为25%，分别接种2%，3%，4%，5%，6%的冠突散囊菌孢子悬液，用无菌透气封口膜封口，于温度28 ℃，湿度80%的恒温恒湿箱中发酵7 d，通过感官评分确定接种量。

（3） 发酵时间对牛蒡发酵效果的影响。取一定质量的牛蒡片，加无菌水至初始水分含量为25%，接种10%的冠突散囊菌孢子悬液，用无菌透气封口膜封口，于温度28 ℃，湿度80%的恒温恒湿箱中发酵5，7，9，11，13 d，通过感官评分确定最佳发酵时间。

（4） 响应面优化试验设计。基于单因素试验结果，以发酵牛蒡茶感官评价评分为响应值进行三因素三水平响应面试验优化发酵牛蒡茶的生产工。

响应面设计因素编码及水平见表1。

表1 响应面设计因素编码及水平

1.3.4 牛蒡茶的泡制与感官评价

（1） 牛蒡茶的泡制。以GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》为依据，取各试验组的发酵牛蒡茶3 g 放入审评杯里，杯中倒入150 mL 沸水，盖上杯盖静置2 min，将茶水倒进品评杯，再泡第2 次，静置5 min，倒出茶水。

（2） 感官评定。邀请10 名已经修完“感官评价”课程的学生首先对第1 次冲泡茶汤的汤色、茶底的香气、茶水的滋味进行评价，对第2 次冲泡茶汤的香气、底色、汤色、滋味继续进行评定。参考GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》，并稍作修改，通过30%滋味+ 30%香气+ 20%外形+ 20%汤色作为计算基准得出具体分数。评价前先按表2 中的评分依据进行说明。

表2 感官评价标准

感官评价标准见表2。

2 结果与分析

2.1 冠突散囊菌发酵牛蒡茶的工艺确定

2.1.1 基质含水量对发酵茶感官评分的影响

基质含水量对发酵茶感官评分的影响见图1。

图1 基质含水量对发酵茶感官评分的影响

基质含水量会影响冠突散囊菌的生长情况，也会对基质的活性成分产生影响。由图1 可知，随着基质含水量的提高，发酵牛蒡茶的感官评分先升后降，当基质含水量为25%时，感官评分最高为87.29 分，此时牛蒡茶表面被金黄色菌花所覆盖，具有“金花菌”的香味，无不良的风味，说明冠突散囊菌在此含水量下生长状况优良。水分含量过低或者偏高时，感官评分较低，可能是较低和较高的水分含量都会抑制突散囊菌的生长，影响菌对基质的利用，从而影响发酵茶的感官质量。张波[12]研究表明，20%的含水量是冠突散囊菌发酵葛根时所需的水分条件，与试验结果相近。因此，选择25%左右进行响应面优化试验。

2.1.2 接种量对发酵茶感官评分的影响

接种量对发酵茶感官评分的影响见图2。

图2 接种量对发酵茶感官评分的影响

较大的接种量可有效地缩短发酵时间，也能防止杂菌污染，试验中发现随着接种量的增加，冠突散囊菌在牛蒡切片上的菌丝覆盖率越高，色泽由浅黄变金黄，“金花菌”的香气越发浓郁。由图2 可知，接种量低于5%时，在7 d 发酵区间内，牛蒡切片生长正常且没有达到饱和状态，而接种数量越多，其感官评分也就越高；当接种量大于5%时，感官评分开始降低，可能是过大的接种量会导致菌株生长所需的营养物质不足，影响产物合成，代谢废物积累过多，从而致使冠突散囊菌覆盖不均匀，菌丝覆盖程度下降，影响了发酵茶的风味和色泽，降低感官评分。因此，选择5%左右的接种量进行后续优化试验。

2.1.3 发酵时间对发酵茶感官评分的影响

发酵时间对发酵茶感官评分的影响见图3。

图3 发酵时间对发酵茶感官评分的影响

微生物发酵过程中，合适的发酵时间使得菌株充分利用底物进行生物转化，获得较佳的发酵产品。由图3 可知，牛蒡茶的感官评分随着发酵时间增加有上升后下降的趋势，当发酵到9 d 时，感官评分最高；发酵时间少于9 d 时，感官评分一直处于上升阶段，说明冠突散囊菌快速增长，慢慢覆盖牛蒡片，并在生物代谢作用下，底物分解聚合转化成小分子化合物，“金花菌”的香气快速增加，发酵茶的品质自然提升；发酵时间超过9 d 后，感官评分开始下降，可能过长的发酵时间，导致菌株衰退和产生不良的风味。因此，试验控制发酵时间在9 d 左右。

2.1.4 响应面优化发酵工艺试验结果

响应面试验结果见表3。

表3 响应面试验结果

建立冠突散囊菌发酵牛蒡茶工艺参数的回归模型，得到感官评分Y 的响应值对自变量A，B，C 的二次多项式回归方程：

响应面回归模型方差分析见表4。

由表4 可知，回归模型F=471.70，p＜0.000 1，表明该模型极显著，失拟项p 值为0.312 2＞0.050 0，为不显著，说明此回归方程是可信的；回归系数R2=0.977 3，表明该方程具有较好的拟合性，可以用来表示各参数对响应值的影响。R2Adj=0.948 0 表明该模型可以对94.80%的感官评分变化作出合理的解释。总体而言，该结果具有较好的可靠性，且误差较低，符合实际，可用来对冠突散囊菌发酵牛蒡茶试验的分析和预测。一次项C 对感官评分影响显著（p＜0.05），二次项A2，B2，C2对发酵茶感官评分影响都为极显著（p＜0.01），交互项BC 对感官评分影响显著（p＜0.05）。由图4 可知，发酵时间的曲线最陡峭、等高线最密集，结合表4 中p 值可看出，3 个因素对发酵牛蒡茶感官评分影响的顺序为发酵时间＞接种量＞基质含水量，而发酵时间和接种量的交互作用对结果影响最大。

图4 B，C 交互作用对发酵牛蒡茶感官评分影响的等高线图和曲面图

根据响应面试验模型预测的冠突散囊菌发酵牛蒡茶的最佳发酵工艺条件为基质含水量25.09%（以牛蒡切片质量为基准），接种量4.87%，发酵时间9.27 d，此条件下感官评分为预测为91.51 分。为便于实际操作，调整为基质含水量25.00%，接种量4.87%，发酵时间9.5 d，并在此条件下再进行3 次平行验证试验，所得产品的感官评分为92.13 分，与模型预测得分接近，说明该模型预测具有一定的可靠性，优化条件较为合理。

B，C 交互作用对发酵牛蒡茶感官评分影响的等高线图和曲面图见图4。

2.2 牛蒡切片与发酵牛蒡茶感官评价结果

根据外形、气味、滋味、汤色4 项指标对牛蒡切片和冠突散囊菌发酵的牛蒡茶成品进行比较。

牛蒡切片与发酵牛蒡茶对比见图5，发酵前后牛蒡感官评定见表5。

图5 牛蒡切片与发酵牛蒡茶对比

表5 发酵前后牛蒡感官评定

在外形方面，牛蒡切片为白褐色，表面较粗糙且颗粒感强，发酵牛蒡茶成品表面均匀覆盖金黄色的菌丝；在香气方面，牛蒡茶成品有青丝味，而发酵牛蒡茶后则带有清新的花果香和烘焙的焦香。经过热水冲泡3 min 后，牛蒡切片呈浅黄色、有苦涩感和草药味、入口清淡，发酵牛蒡茶茶汤金黄澄清、无苦涩味、富有“金花菌”的风味、甘甜醇厚。由于冠突散囊菌在增长繁殖过程中，牛蒡活性成分的氧化、降解和生物转化，使得发酵牛蒡茶茶汤滋味醇厚，而水溶性褐色素的分泌又增进了茶汤的色泽[13]。

3 结论

通过响应面优化试验得到冠突散囊菌发酵制备牛蒡发酵茶的最佳工艺为牛蒡基质含水量25.00%，接种量4.87%，发酵时间9.5 d，在此条件所得产品茶汤金黄澄清、无苦涩味，富有“金花菌”的风味、甘甜醇厚，感官评分达到91.51 分。发酵后牛蒡茶的品质得到改善，具体的变化规律和机制需要进一步进行研究。