章瑞琪，郭 虹

（丽水学院医学院，浙江 丽水 323000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种骨髓和外周血髓系细胞发育受阻的恶性肿瘤，主要表现为髓系原始细胞增殖不受控制，骨髓分化受抑制，从而抑制正常血细胞的发育。该病占白血病总发病数的50%以上，其中在AML 亚型之中M2与M5的发病率较高［1］。而AML的发生、发展、治疗和预后与转录因子CCAAT 增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）的异常表达密切相关。在中国AML成年患者中，约有11.7%患者的CEBPA基因突变阳性［2］，这干扰了CEBPA基因的正常表达，阻碍了其功能的发挥。而正常表达的转录因子C/EBPα因含有碱性亮氨酸拉链结构域，可以通过形成二聚体、与目标基因的启动子区结合、调控转录激活等手段发挥其对维持血液系统稳定的功能：维持造血干细胞的自我更新、支持粒细胞的分化，并参与调节细胞周期与新陈代谢过程。

为进一步阐释C/EBPα 的异常表达与AML 间的作用机制，笔者利用生物信息学技术探究C/EBPα的靶基因，并通过分析靶基因的功能与信号转导通路，进一步了解C/EBPα 的转录调控功能，且重点揭示靶基因信号转导通路（JAK-STAT信号通路、MAPK通路、PI3K-Akt通路），总结它们对维持正常血液系统的功能和在AML 发生、发展及治疗过程中的作用与影响，揭开C/EBPα通过靶基因信号转导通路在AML 中的潜在机制，并进而为AML临床治疗与预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据获取

通过GeneCards 数据库（http：//www.genecards.org）检索得到107个与AML相关的基因，将其作为候选预测靶基因。在基因表达数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索得到包含敲除Cebpa基因的实验组与对照组的GSE146288、GSE153622、GSE71687数据集。

1.2 筛选差异表达基因

运用GEO 数据库提供的GEO2R 分析工具对上述107 个候选预测靶基因的表达量进行综合分析，筛选Cebpa敲除前后的差异表达基因，得出其在Cebpa基因敲除前后的比较结果。

1.3 差异基因的GO功能与KEGG富集分析

为进一步解释差异表达基因在AML发病过程中发挥的作用，对C/EBPα的42个差异表达靶基因进行分析。借助DAVID 数据库综合分析工具（http：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，筛选显著差异的数据（P＜0.05），探索差异基因潜在影响的功能与通路。

1.4 C/EBPα 与信号通路中差异表达基因的蛋白质互作网络

利用STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/）分析调控网络中的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI），对KEGG 富集分析结果中的JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路与PI3K-Akt 信号通路中所包含的基因进行分析，构建其与C/EBPα之间的蛋白质互作网络。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因结果

运用GEO2R分析工具对上述107个候选预测靶基因的表达量进行综合分析，得出其在Cebpa基因敲除前后的比较结果（见表1），将表达量随Cebpa基因敲除而下降的基因作为预测靶基因，共42个，并对这些差异表达基因开展深入研究。

表1 Cebpa基因敲除后AML相关基因表达

2.2 差异基因的GO功能富集

借助DAVID 综合分析工具对C/EBPα的42个差异表达靶基因进行GO富集分析，筛选显著差异的数据（P＜0.05），得到GO 富集分析结果：主要富集于26个基因功能，按生物学过程、细胞组分和分子功能3类基因功能分类，分类结果如图1所示。

图1 C/EBPα预测靶基因的GO功能富集分析

由观察分析结果可知：在生物学过程分类中，差异基因主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、造血、基因表达的正向调控等。在细胞组分分类中，差异基因主要富集于细胞核、转录因子复合物、染色质等。在分子功能分类中，差异基因主要富集于蛋白质结合、染色质结合、转录因子结合、DNA结合等。

2.3 差异基因的KEGG通路分析

在GO功能富集分析的基础上，利用DAVID综合分析工具进行KEGG富集分析，筛选差异显著的数据（P＜0.05），得到KEGG 富集分析结果，结果如图2所示：差异基因主要富集于癌症的通路、急性髓性白血病、癌症中的转录失调、癌症中的微小RNA、慢性粒细胞白血病、PI3K-Akt 信号通路、JAKSTAT信号通路、乙型肝炎、造血细胞谱系、MAPK信号通路。差异基因在癌症的通路中富集最多，共有15 个基因富集于此通路。借助STRING 在线数据库，绘制PI3K-Akt 信号通路、JAK-STAT信号通路与MAPK信号通路网络图，结果如图3所示。

图2 C/EBPα预测靶基因的KEGG信号转导富集分析

图3 KEGG信号通路的蛋白质互作网络

2.4 C/EBPα与信号通路的蛋白质互作网络

分别将JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路与PI3K-Akt 信号通路所包含的蛋白基因导入STRING在线数据库，获取上述通路中所包含差异基因与C/EBPα的相互作用网络，结果如图4所示：C/EBPα与JAK-STAT信号通路所包含的差异基因间共有6 条相互作用关系；C/EBPα 与MAPK 信号通路所包含的差异基因间共有6条相互作用关系；C/EBPα 与PI3K-Akt 信号通路所包含的差异基因间共有5条相互作用关系。

图4 C/EBPα与MAPK、JAK-STAT及PI3K-Akt信号通路的蛋白质互作网络

3 讨论

转录因子C/EBPα 的异常表达对AML 的发病及预后产生重要影响，研究表明C/EBPα能够调节造血干细胞的细胞周期，促进中性粒细胞的分化，对骨髓发育起着重要作用。大部分AML患者的C/EBPα 表达量下降，但C/EBPα 不同的突变形式影响着AML 患者的预后，C/EBPα 单突变的AML 患者往往预后较差［3］，而C/EBPα双突变的AML患者的死亡率较低，往往预后较好［4］。这说明C/EBPα的不同表达会对AML的发病与预后产生不同的影响，借助生物信息学技术，研究C/EBPα 靶基因功能及其信号通路，有利于进一步揭示AML 的发病机理，同时为临床开发针对C/EBPα靶点的免疫治疗药物提供理论支持。

本研究主要运用生物信息学技术，在GEO 数据库中筛选敲除Cebpa基因的实验组及正常造血干细胞间的差异表达基因，发现差异表达基因共86 个，其中共有42 个基因随Cebpa基因的敲除而表达下降，将其作为预测靶基因进行了GO 功能分析和KEGG 通路富集分析，结果发现这些基因在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、造血、基因表达的正向调控等功能上富集，并且很可能通过JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路及PI3K-Akt信号通路发挥作用。不仅如此，我们还证明了C/EBPα 与JAK-STAT 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt信号通路中所包含的差异表达基因有互相作用，提示C/EBPα 功能的发挥与上述3 条通路的信号传导具有密切联系，推测转录因子C/EBPα可能通过JAK-STAT 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt信号通路的传导对急性髓系白血病的发病与预后产生一定影响。

已有研究已论证：JAK-STAT信号通路在非典型C/EBPα双突变的AML患者中会被异常激活，破坏其原有抗肿瘤作用，使得稳态失衡，进而加剧AML患者的病情发展［5］；MAPK信号通路主要包括MEK1/2-ERK1/2 通路、JNKs 通路、p38 通路及MEK5-ERK5-MEF2C 通路4 类信号通路，在调控细胞增殖、凋亡及细胞周期方面发挥着重要作用［6-8］，其中MEK1/2-ERK1/2 通路活性的增强，会下调C/EBPα 的表达量，从而抑制粒细胞分化，进而诱导AML 的发生［9-10］，而MEK5-ERK5-MEF2C通路也能够通过调控转录因子C/EBPα 与C/EBPβ来引导髓系分化［11］；PI3K-Akt 信号通路能够控制C/EBPα 的磷酸化，以此介导骨髓细胞正常发育［12］，而该通路的过度激活往往会导致AML 细胞不受控制的增殖［13］。这些论据均说明C/EBPα 的异常表达对AML患者的影响与JAK-STAT信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路的传导密不可分。

综上所述，本研究筛选出与C/EBPα表达相关的差异基因，并分析所述基因的功能及其相关信号通路，研究结果有助于探索寻求临床治疗AML的免疫靶点，为揭示AML 发生发展过程提供理论基础。