陈卫平，何志豪，王伟影，章小洪，陈 梦

（丽水市质量检验检测研究院，浙江 丽水 323000）

罂粟壳属于国家管制药品，具有止咳、镇痛等功效，但也存在一定成瘾性，部分不法商贩利用其成瘾性特点在食品中非法添加罂粟壳以达到吸引回头客的目的［1-2］。目前食品中罂粟壳生物碱的检测方法尚无国家标准。《食品安全监督抽检实施细则（2022 年版）》［3］明确的检测方法是2018 国家市场监督管理总局发布的BJS 201802《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》规定的方法［4］，该法仅限于调味品和火锅食品，适用范围小，对于可能添加罂粟壳生物碱的食品，例如对调味面制品、功能性饮料等不适用。目前尚未发现同时针对高油脂、高蛋白、高水分食品中罂粟壳生物碱的相关检测报道。本研究选取了4 种有代表性的食品（火锅底料、酱卤肉、调味面制品、功能性饮料）作为研究对象，采用阳离子固相萃取柱对样品进行净化，优化色谱和质谱条件，考察基质效应的影响，运用阳离子固相萃取-高效液相色谱-质谱法测定食品中5种罂粟壳生物碱，旨在扩展食品中罂粟壳生物碱的检测范围，为检测食品中罂粟壳生物碱残留量提供技术支撑。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱-质谱仪（美国Waters公司）；超纯水发生器（德国Think-lab公司）；ST16高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；Micro17高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；DMT-2500多管涡旋混合仪（杭州米欧公司）；MS3 basic涡旋（德国IKA公司）。

1.2 试剂

吗啡（含量：97.9%，批号：171201-201123，中国药品生物制品检定所）；可待因（含量：100%，批号：171203-200303，中国药品生物制品检定所）；罂粟碱（含量：99.9%，批号：0704-RA-0012，CATO）；那可丁（含量：98.32%，批号：TC201128-18，Stanford Chemicals）；蒂巴因（含量：100%，批号：171216-200403，中国药品生物制品检定所）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国默克公司）；盐酸（优级纯，广东西陇科学）；甲酸、氨水（色谱纯，上海CNW公司）；甲酸铵（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）；MCX固相萃取柱（500 mg/6mL，北京凯斯科公司）；SCX 固相萃取柱（500 mg/6mL，北京凯斯科公司）；WCX固相萃取柱（500 mg/6mL，上海艾杰尔公司）；有机相滤膜（0.22 μm，天津津腾公司）；Acquity UPLC BEH HILIC 色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）。

2 方法与结果

2.1 品前处理

提取：准确称取混匀试样2 g 于50 mL 离心管中，加入25 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液-乙腈（体积比1∶4），涡旋振荡1 min，4 000 r/min 离心5 min，提取液待净化。

净化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 乙腈、6 mL 水活化，准确移取5 mL 提取液以2～3 mL/min 的速度上柱，依次用6 mL 水、6 mL 乙腈淋洗，最后用6 mL 5%氨化乙腈洗脱，收集洗脱液，40 ℃水浴旋蒸至近干，氮气吹干，加入1 mL 乙腈复溶，经0.22 μm 有机相滤膜过滤，供高效液相色谱-质谱仪测定。

2.2 标准溶液的配制

准确称取5 种生物碱标准品，用体积分数为0.5%的甲酸甲醇溶液配制成质量浓度均为1.0 mg/mL的标准储备液，准确吸取那可丁、罂粟碱、蒂巴因标准储备液各1.0 mL，可待因、吗啡标准储备液各5.0 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，作为混合标准溶液。移取适量混合标准溶液用空白样品提取液配制基质标准工作溶液，罂粟碱、那可丁、蒂巴因质量浓度为1、2、5、10、50、100 ng/mL，吗啡、可待因质量浓度为5、10、25、50、250、500 ng/mL。

2.3 仪器条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱：HILIC 色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；进样量：1 μL；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序及流动相见表1。

2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子；载气：高纯氮气；碰撞气：高纯氩气；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；毛细管电压：3.0 kV；检测方式：多反应监测；其他参数见表2。在该仪器条件下，标准溶液的色谱图见图1。

图1 5种生物碱和2种同位素内标的总离子流图

表2 质谱参数

2.4 线性关系、检出限与定量限

分别吸取混合标准溶液适量，用空白样品提取液稀释液配制基质标准工作溶液，那可丁、蒂巴因、罂粟碱质量浓度为1、2、5、10、50、100 ng/mL，吗啡、可待因质量浓度为5、10、25、50、250、500 ng/mL，采用外标法定量，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，分别以5 种生物碱色谱峰的3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量分数来计算检出限、定量限，见表3。

表3 标准工作曲线、检出限和定量限

2.5 回收率与精密度

取空白样品（火锅底料、酱卤肉、调味面制品、功能性饮料）添加低、中、高（5、25、50 μg/kg）质量分数水平的混合标准溶液进行回收率试验，每个质量分数水平重复测定6 次，回收率64.6%～110.9%，相对标准偏差1.2%～15.5%（表4），试验结果符合GB/T 27403—2008检测方法确认的技术要求，表明本方法具有较好的通用性。

表4 回收率和精密度

2.6 实际样品分析

对市售的20 份食品样品（火锅底料、酱卤肉、调味面制品、功能性饮料各5 份）采用笔者所建立的试验方法进行测定，其中有一份火锅底料疑似检出罂粟壳生物碱，质量分数为47.6 μg/kg，为排除其假阳性情况，将进一步采用高分辨质谱仪进行定性确证［5-6］。

3 讨论

3.1 样品前处理方法的优化

5种生物碱呈碱性或两性，在酸性条件下形成易溶于水的盐类，样品用乙腈提取，提取液经盐析处理后转移至乙腈相中，本试验分别考察了0.1 mol/L 盐酸溶液-乙腈（体积比1∶1）、0.1 mol/L盐酸溶液-乙腈（体积比1∶2）、0.1 mol/L盐酸溶液-乙腈（体积比1∶4）作为提取溶剂的提取效果。以体积比1∶1为提取溶剂时，提取效率低且样品易乳化，随着提取溶剂有机相比例升高，吗啡、可待因的回收率有一定程度提高，因此选择0.1 mol/L 盐酸溶液-乙腈（体积比1∶4）作为提取溶剂。

目前文献报道的前处理方法主要是操作简便的QuEChERS 法［7-8］，然而在试验过程中发现分散固相萃取剂C18、PSA对吗啡和可待因的吸附能力较强，易导致回收率较低，固相萃取法［9-10］利用吸附剂将样品中的目标化合物吸附然后再洗脱，实现目标物的分离和富集，增强对分析物的检出能力。生物碱盐酸溶液提取后呈阳离子状态，因此考虑采用阳离子固相萃取柱。笔者选择离子交换能力不同的固相萃取柱净化样品提取液，SCX 强阳离子固相萃取柱、MCX 弱阳离子固相萃取柱、WCX 弱阳离子固相萃取柱，回收率结果如图2 所示。结果显示样品提取液经SCX 柱净化后5 种罂粟壳生物碱回收率均较差，经WCX 柱净化后罂粟碱、蒂巴因和那可丁回收率有一定程度提升，然而吗啡、可待因回收率低于10%，经MCX 柱净化后，生物碱回收率为47.0%～94.3%。综合考虑目标物回收率和基质效应的影响，选择MCX柱净化样品。

图2 采用不同固相萃取柱时5种生物碱的回收率

3.2 色谱条件的优化

生物碱多呈弱碱性、极性强，在普通的C18 柱上难以实现保留，笔者考虑目标物极性强的特点选择BEH HILIC 亲水色谱柱，并结合高比例有机相、低比例水相实现对极性化合物的保留。由于可待因和吗啡极性相似难以分离，现有文献报道的色谱方法均未能实现有效分离。笔者以甲酸铵为流动相，用甲酸调节流动相pH至5.5，使pH小于目标物pKa（酸度系数），增强目标物保留能力，同时在酸性条件下提升了质谱离子化效率，5种生物碱实现完全分离，色谱峰型好，灵敏度高，具体见图1。

3.3 基质效应消除

采用高效液相色谱-质谱法分析样品时，基质效应在一定程度上会影响定量的准确性［11-12］，样品类型及样品前处理过程均会对基质效应产生不同程度的影响。为减弱基质效应的影响，可以采用空白样品的提取溶液作为标准溶液的稀释液，用相同的离子化条件来消除样品的基质效应。试验证明采用基质标准曲线能有效降低样品基质对吗啡、可待因和那可丁的响应，提高样品回收率。

本研究运用阳离子固相萃取-高效液相色谱-质谱法测定高油脂、高蛋白、高水分食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的残留量，方法准确性高，样品适用性强，有效扩展了罂粟壳生物碱的检测范围，研究结果可为食品安全领域监管提供有力支撑。