张卓航, 芦光新*, 周学丽,2, 王英成, 金 鑫, 郑开福, 李晶晶, 王 杰, 刘欣悦

(1.青海大学农牧学院, 青海 西宁 810016; 2.青海省草原改良试验站, 青海 共和 813000)

丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)作为70%～80%陆生植物的专性有益共生体[1],广泛分布于全球陆地生态系统[2-3],约占土壤微生物生物量的20%～30%[4]。AMF可以促进植物对养分的吸收[5],增加植物的抗旱性[6]、抗盐性[7]、抗金属毒性[8]和抗病虫害能力[9],改变植物-植物间的相互作用,影响植物群落组成[10],调控植物群落结构和生态系统生产力[11],加速受干扰生态系统植被的恢复[12]。

有机肥替代化肥成为实现优化农业结构和提升农牧业绿色发展的重要路径。2019年青海省确定的《全省实施化肥农药减量增效行动总体思路和2019年试点方案》指出,从2019年起到2023年,青海省全省内种植业基本实现从数量型转变为质量型,全面构建以绿色为导向的农业技术体系[13-14],将青海打造成绿色有机农畜产品输出地成为一项重要的民生工程和推动青海高质量发展的重要动力。因此,在“双减行动”和有机肥替代化肥的过程中,田间养分管理面临着如何在满足作物养分需求和保护植物根周与根际土壤生物多样性之间保持平衡,从而保证农业生态系统的可持续性的巨大挑战。前人研究表明施有机肥可以在短时间内增加土壤有机质含量,调节土壤微生物群落组成和多样性[15],增加土壤生物活性[16],也有其他研究表明养分的富集会降低AMF的丰度和多样性[17-18]。

AMF的多样性决定了农业生态系统的功能,AMF的多样性越高,对提高牧草产量、营养、生物多样性和生态系统稳定性的重要性就越大[19]。然而,在高寒地区此类研究目前仍然较少,关于在高寒地区短期施有机肥对土壤AMF群落结构的影响结果与其他地区结果是否一致尚未可知。因此,本试验采用高通量测序技术探究短期施有机肥对高寒地区禾本科牧草土壤AMF群落多样性、组成及分布特征的影响,旨在为绿色发展背景下高寒地区农业生态系统的可持续性发展提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验样地概况

试验地位于青海省铁卜加草原改良试验站,东经99°35′,北纬37°05′,海拔3 270 m。年平均气温-0.7℃,最热月(7月)平均气温17.5℃,最冷月(1月)平均气温-22.6℃,极端温度-34.3℃,无霜期平均为78.7 d,无绝对无霜期,日照时数2 670 h,≥0℃年积温1 331.3℃,年降水量368.11 mm,年蒸发量为1 495.3 mm,相对湿度58%。

1.2 试验设计

试验于2020年5月开始,在禾本科牧草种植田进行田间试验,设置有机肥(F)与不施肥(CK)处理,每个处理3次重复,小区随机排列,每个小区面积15 m2(3 m×5 m),有机肥在种植时作为基肥一次性施入,施肥处理小区施有机肥量为7.88 kg(施肥量依据有机肥袋标准)。

1.3 试验材料

牧草品种:‘川草2号’老芒麦(ElymussibiricusL.‘Chuancao No.2’)(购自于四川省川草生态科技有限责任公司)。

有机肥:以富含有机质的农作物秸秆和家禽粪便为主要原料并添加生物发酵剂,有机质含量≥45%,N+P2O5+K2O≥5%,pH值为5.5～8.5(购自于四川农业大学资源学院)。

1.4 研究方法

1.4.1样品采集 土壤样品于2020年9月采集,在每个小区中,随机选择长势均匀的2个1 m×1 m的样方进行采样,共12个样方。选好样方后,齐地面剪去植株的地上部分后,用无菌铁铲垂直于地面挖出30 cm深度的根系,从根系抖落的土作为根周土,用无菌刷子刷下粘附在根上的土作为根际土,均质化并过无菌筛(<2 mm)以去除根部及其他植物材料。将土壤样品于4℃车载冰箱运至实验室,分为两部分,一部分用于理化性质的测定,另一部分储存于-80℃冰箱用于DNA提取。

1.4.2土壤理化性质测定 土壤样品风干、磨碎,过0.25 mm孔径网筛后进行土壤养分测定。土壤总氮(Total nitrogen,TN)含量用凯氏定氮法测定;土壤铵态氮(Ammonium nitrogen,NH4-N)含量用靛酚蓝比色法测定;土壤硝态氮(Nitrate nitrogen,NO3-N)含量用紫外分光光度法测定;有机质(Organic matter,OM)含量用重铬酸钾氧化-油浴加热法测定;土壤pH值用pH计(pHS-3C)测定。

1.4.3根周与根际土壤AMF群落多样性和组成测定 将装有样品的无菌管从-80℃冰箱中取出解冻,在超净工作台中取出10 g土壤样品,用土壤DNA试剂盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美国)提取24个土壤样本的微生物总DNA。用Nanodrop2000测定提取DNA的浓度与纯度,浓度均在20 ng·μL-1以上,A260/A280为1.8～2.0。利用特定引物(上游引物gITS5.8F:5′-AACTTTYRRCAAYGGATCWCT-3′;下游引物ITS4R:5′-AGCCTCCGC-TTATTGATATGCTTAART-3′)对土壤样本进行ITS rRNA基因扩增、建库并送至广州美格基因科技有限公司在Illumina Miseq平台测序。

1.5 数据处理

利用中科院环境所邓晔老师课题组的Galaxy分析平台(http://mem.rcees.ac.cn:8080/)对微生物原始数据进行分析,使用Trim Primer去除正反向引物,FLASH进行正反序列拼接,Trim by sequence length对序列进行筛选与修剪,保留长度在245～265 bp的目的序列。目的序列通过Unoise的方法进行操作分类单元(Operational taxonomic units,OTU)归类,生成原始OTU表,为了使每个样品序列数相同,以Resample OTU table对数据进行重抽,重抽得到的OTU进行后续分析。对重抽的OTU表用RDP分类数据库进行注释。通过物种组成和FUNGuild[20]筛选出AMF的OTU,进行后期统计分析。通过多重比较分析(LSD)和T检验对土壤理化性质和AMF的α多样性进行显著性分析。通过基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)、主坐标分析(Principal coordinate analysis,PCoA)和不相似检验(dissimilarity test)对CK与F的土壤AMF群落进行β-多样性差异分析。通过Mentel检验和Pearson分析对根周和根际土壤AMF菌属与环境因子进行相关性分析。使用Microsoft Excel 2021,IBM SPSS Statistics 20,Origin 2023,RStudio软件分别进行整理数据、统计分析以及结果的可视化。

2 结果与分析

2.1 施用有机肥后土壤理化性质的变化

施有机肥改变了土壤养分含量,与CK相比,有机肥显著增加了土壤总氮含量(P<0.05),降低了铵态氮、硝态氮含量和土壤pH值,但变化均不显著(表1)。

表1 土壤理化性质Table 1 Soil physical and chemical properties

2.2 施用有机肥后根周与根际土壤AMF种类和数量的变化

24个样本经高通量测序共获得8 145 681条序列,在97%的相似性水平下,得到2 733个真菌OTU,均能被FUNGuild注释,其中筛选出43个AMF的OTU。对根周和根际CK与F间共有和独有OTU进行可视化(图1),结果显示,四个处理中AMF共有15个OTU,占全部OTU的34.9%;根周土壤CK与F中AMF共有20个OTU,占全部OTU的46.5%;根际土壤CK与F中AMF共有18个OTU,占全部OTU的41.9%;根周施肥土壤中AMF(ZF)拥有最多独有OTU(4个),占全部OTU的9.3%。

图1 不同处理组AMF群落共有和独有OTU韦恩图Fig.1 Common and unique OTU Venn diagram of soil AMF community in different treatment groups注:JCK为不施肥根际;JF为施肥根际;ZCK为不施肥根周;ZF为施肥根周。下同Note:JCK stand for rhizosphere without fertilization;JF stand for rhizosphere with application of organic fertilizer;ZCK stand for around the root without fertilization;ZF stand for around the fertilized root. The same as below

检测总AMF相对丰度在真菌中所占比例的变化,结果表明,CK中,根周总AMF相对丰度低于根际总AMF相对丰度;施有机肥后,根周与根际土壤中总AMF的相对丰度均显示增加,根周显著增加。因此,短期施有机肥可以增加根周与根际总AMF的相对丰度(图2)。

图2 根周和根际土壤总AMF相对丰度变化Fig.2 Changes in relative abundance of total AMF around the root soil and in rhizospheric soil注:*为相关性在0.05水平显著Note:* is significant at the 0.05 level

科水平上,共检测到土壤AMF有6个科(图3a):近明囊霉科(Claroideoglomeraceae,51.59%～69.02%)、内养囊霉科(Entrophosporaceae,17.19%～23.72%)、球囊霉科(Glomeraceae,2.89%～12.34%)、未知菌科(Unclassified,2.42%～11.98%)、散囊菌科(Diversisporaceae,0.32%～2.15%)和Leotiomycetes incertae sedis(0%～0.52%)。土壤AMF群落中的优势菌科为近明囊霉科,其相对丰度大于50%;与CK相比,施有机肥后,根周与根际AMF群落中球囊霉科相对丰度显著增加,近明囊霉科相对丰度降低,根周内养囊霉科相对丰度增加,根际Leotiomycetes incertae sedis消失。

属水平上,共检测到土壤AMF有7个属(图3b):近明球囊霉属(Claroideoglomus,51.59%～69.02%)、内养囊霉属(Entrophospora,17.19%～23.72%)、未知菌属(Unclassified,2.42%～11.98%)、球囊霉属(Glomus,2.43%～12.34%)、管柄囊霉属(Funneliformis,0%～9.17%)、多样囊霉属(Diversispora,0.32%～2.15%)、锤苔舌菌(Leohumicola,0%～0.52%)。土壤AMF群落中的优势菌属为近明球囊霉属,相对丰度大于50%;与CK相比,施有机肥后,根周和根际AMF群落中近明球囊霉属相对丰度降低,分别降低了7.41%和13.78%;根际球囊霉属相对丰度显著增加,管柄囊霉属和锤苔舌菌消失;根周内养囊霉属、球囊霉属和多样囊霉属的相对丰度降低,出现管柄囊霉属。

2.3 施用有机肥后根周与根际土壤AMF物种多样性的变化

老芒麦根周和根际土壤AMF群落α多样性分析发现,与CK相比,施有机肥显著增加了根周土壤AMF群落的Shannon指数(P<0.05),极显著增加了丰富度和Chao1指数(P<0.01);根际土壤AMF群落的α多样性均无显著变化;根周土壤AMF群落丰富度和Chao1 指数显著高于根际土壤。该结果表明短期施用有机肥对土壤AMF多样性的影响表现为根周大于根际(图4)。

图4 根周和根际土壤AMF群落α多样性Fig.4 The α diversity of AMF community around the root soil and in rhizospheric soil注:*为相关性在0.05水平显著,**为相关性在0.01水平显著Note:* is significant at the 0.05 level,and ** very significant at the 0.01 level

2.4 根周与根际土壤AMF群落结构分析

对老芒麦根周和根际土壤AMF群落进行NMDS分析、主坐标分析,并进行不相似检验分析验证。如图5、图6和表2所示,CK中根周土壤AMF群落和根际土壤AMF群落间无明显的空间分布,即根周与根际土壤AMF群落间不存在显著差异。施有机肥后,根周和根际土壤中AMF在图5和图6中的距离均较近,说明施有机肥前后根周与根际土壤中AMF群落结构无较大差异。Bray-Curtis距离的不相似检验结果中,各处理组间均无显著差异,表明高寒人工草地中,老芒麦根周和根际土壤中AMF的群落结构较为稳定,不易受短期施有机肥的影响。

图6 不同处理组AMF的主坐标分析Fig.6 Principal coordinate analysis of AMF in different treatment groups

表2 基于AMF群落Bray-Curtis距离的不相似检验Table 2 Dissimilarity test of E.sibiricus based on Bray-Curtis distance of AMF community

2.5 根周与根际土壤AMF与环境因子相关性分析

老芒麦土壤AMF与环境因子的相关性分析和Mantel检验结果显示(图7),优势菌属近明球囊霉属相对丰度与硝态氮含量呈显著正相关关系(P<0.05);内养囊霉属相对丰度与牧草鲜重和干重呈显著正相关关系(P<0.05),与硝态氮含量呈极显著正相关关系(P<0.01);未知菌属相对丰度与pH值呈显著正相关关系(P<0.05),与牧草鲜重和干重呈极显著正相关关系(P<0.01);锤苔舌菌相对丰度与总氮含量呈显著正相关关系(P<0.05)。老芒麦土壤AMF的多样性与环境因子Pearson相关性分析结果显示(表3),土壤AMF的Shannon指数与总氮含量呈显著正相关关系(P<0.05),Inv_Simpson指数与pH值和牧草鲜重呈极显著负相关关系(P<0.01)。

图7 土壤AMF与环境因子相关关系图Fig.7 Correlation diagram of soil AMF and environmental factors注:TN为总氮;NH4-N为铵态氮;NO3-N为硝态氮;OM为有机质;frseh.weight为牧草鲜重;dry.weight为牧草干重。图中AMF与环境因子间连线反映了它们之间的相关性,连线越粗,相关性越强Note:TN stands for total nitrogen;NH4-N stands for ammonium nitrogen;NO3-N stands for nitrate nitrogen;OM stands for organic matter;frseh.weight stands for fresh weight of forage grass;dry.weight stands for dry weight of forage grass. The connection between AMF and environmental factors in the diagram reflects the correlation between them. The thicker the connection line,the stronger the correlation relation

表3 根周与根际土壤AMF的α多样性与环境因子Pearson相关性分析Table 3 Pearson correlation analysis between α diversity of AMF around the root and rhizospheric soil and environmental factors

3 讨论

3.1 有机肥对根周与根际土壤AMF丰度和多样性的影响

AMF作为植物的专性生物营养物质,在营养元素循环、土壤碳固持和生态系统稳定性等方面具有重要作用[21-22]。研究结果表明,有机肥显著增加了老芒麦根周土壤AMF群落物种丰富度和生物多样性(图4),该结果与张琳[23]和VAN等[24]的结果一致。有机肥通过产生刺激菌丝生长的物质,增加AMF群落丰富度和多样性,进而增加植物的生物多样性、养分捕捉能力和生产力[23-24]。施有机肥后,老芒麦根周土壤AMF群落多样性和物种丰富度显著增加,根际土壤AMF群落多样性无显著变化,物种丰富度降低,根周土壤结果与江尚焘等[25]的结果一致,根际土壤结果与其有一定差异(图4)。施有机肥会提高AMF的侵染率、孢子密度[26]、多样性和物种丰富度[27],同时也会对AMF群落产生负面影响[28]。结果出现差异的原因可能是施肥时间长短不同、地区不同的AMF组成存在地理差异[27]。

3.2 有机肥对根周与根际土壤AMF群落结构的影响

施有机肥会改变土壤理化性质,影响土壤微生物群落结构[29],进而影响老芒麦根周和根际AMF群落结构变化。本研究结果表明,有机肥降低了老芒麦根周和根际土壤中AMF的优势菌属近明球囊霉属的相对丰度(图3b),该结果与刘文娟等[30]的研究结果有机肥会降低土壤AMF优势菌属的相对丰度一致。同时,有机肥改变了根周和根际土壤中AMF的物种组成,根际土壤中的管柄囊霉属转移到了根周土壤中(图3b)。根周和根际土壤AMF群落的NMDS分析(图5)、PCoA(图6)和不相似检验(表2)结果均显示四个处理组中AMF群落间不存在显著差异。该结果表明有机肥对根周和根际土壤中AMF群落结构无显著影响,但会对根周和根际土壤中AMF群落的物种组成造成影响。

3.3 根周与根际土壤AMF与环境因子的关系

AMF群落与环境因子的研究表明,施有机肥增加了土壤养分,进而引起AMF群落多样性的变化[31]。在不同生态系统中,环境因子特别是pH值、氮和微量元素对AMF群落具有显著影响[32]。本研究Pearson相关性分析(表3)结果显示,土壤pH值和牧草鲜重对AMF群落多样性影响最大,pH值和牧草鲜重与Inv_Simpson指数呈极显著负相关关系。曹敏等[33]的结果为土壤pH与Shannon指数呈正相关,与本实验结果相反,出现差异的原因与土壤酸碱性不同有关,曹敏等的研究样点土壤pH均为酸性,而本研究中土壤pH均为中性。环境因子与AMF菌属之间的相关性(图7)结果显示,内养囊霉属和未知菌属相对丰度受环境因子影响最大,硝态氮含量、牧草鲜重和干重为主要影响因子。近明球囊霉属相对丰度与总氮和硝态氮含量呈负相关关系,球囊霉属相对丰度与pH值呈正相关关系,该结果与杨文莹[34]和周静怡等[35]结果一致,但部分结果也存在差异,球囊霉属相对丰度与总氮和有机质含量呈负相关关系,多样囊霉属相对丰度与总氮含量呈负相关关系,出现该差异的原因与施用有机肥时间较短、试验地海拔高、气压和温度低对部分AMF生长产生抑制作用有关[36]。

4 结论

本研究利用高通量测序对高寒地区‘川草2号’老芒麦短期施有机肥的根周和根际土壤AMF群落多样性和组成,以及其与环境因子的相关性分析,老芒麦共生的AMF共有7个属,根周土壤中AMF的物种数大于根际土壤。土壤pH值和牧草鲜重对AMF群落多样性影响最大;施有机肥显著增加土壤总氮,与土壤AMF多样性呈显著正相关关系;有机肥增加了根周土壤AMF的多样性和物种丰富度,但降低了根际土壤AMF的物种丰富度,并且有机肥的添加降低了根周和根际土壤AMF优势菌属近明球囊霉属(Claroideoglomus)的相对丰度。本研究解析了在高寒地区短期施有机肥对禾本科牧草根周和根际AMF群落和多样性的影响,为深入了解高寒地区牧草种植地田间养分管理和AMF多样性之间关系提供理论依据。