伍丰宇, 邹博坤, 李晓霞, 钱永强*

(1.中国林业科学研究院生态保护与修复研究所, 北京 100091; 2.国家林业和草原局草原研究中心, 北京 100091)

植物新品种保护(Plant variety protection act,PVP)即植物育种者权利,是指国家有关审批机关按照相关认定程序依法授予育种人或单位对该植物新品种的生产、销售、使用的排他独占权。PVP在保护育种者权利、促进农林业健康发展与持续创新、维护国家国际竞争力方面起到了重要作用[1]。为了更加有效地建立起植物鉴定与保护体系,推动世界植物新品种的发展,1961年在巴黎通过的《保护植物新品种国际公约》(后文简称公约)建立了一个政府间的国际组织:国际植物新品种保护联盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV)。公约后于1972年、1978年、1991年进行了补充修订[2],我国于1999年加入UPOV,受1987年文本约束[3]。公约在促进协约各成员国在法律与技术上的合作、加快植物新品种的繁育生产速度、加速建立国际植物知识产权体系、维持农林业的可持续发展与创新等方面起到了不可忽视的作用[4-5]。公约规定各签约国需要依照公约制定植物新品种审定标准,对申请的植物新品种进行特异性、一致性和稳定性(Distinctness,uniformity,stability,简称DUS)的测试,并且需要在协调各成员国之间政策、法律、测试步骤等的差异性与维持国际一致性下,授予植物新品种育种者个人或单位相关PVP权利,保护与协调育种者和用户之间的利益合理分配[6-7]。

植物DUS测试是判定植物是否属于新品种的重要依据,而DUS测试指南则是植物DUS测试的基础[8]。植物新品种DUS测试指南由UPOV或者各UPOV成员国依据本国法律法规和植物生长实际情况测试并制定,是对申请的植物新品种的描述以及审查标准,并向社会公开[9]。截至2022年12月,UPOV共发布了338种/属植物的测试指南[10],但是各国因国情不同制定的DUS测试指南在种类和数量上有所差别。截至2022年12月,我国林业新品种保护名录共收录293种/属植物[11],农业新品种保护名录共收录191种/属植物[12]。其中已有的农业植物DUS测试类型(植物类型按最常见类型统计)不多且大部分局限于经济作物与观赏类植物,关于牧草类植物的DUS测试指南制定的只有11种属,其中禾本科有高羊茅(Festucaarundinacea)、草地羊茅(Festucapratensis)、狗牙根(Cynodondactylon)、黑麦草(Loliumperenne)、鸭茅(Dactylisglomerate)、结缕草属(ZoysiaWilld.)、狼尾草属(PennisetumRich.)7种,与UPOV发布的牧草类DUS测试指南数量的21种还有较大差距。由于必要的测试指南能够更好地帮助种质资源的合理利用并且禾本科在牧草植物中占重要地位,所以未来适合我国其他牧草的DUS测试指南的研发将会越来越被重视,补全其他牧草特别是禾本科牧草的DUS测试指南是目前我国牧草植物新品种保护的重中之重。

野牛草(Buchloedactyloides)是原产于北美草原的多年生暖季型牧草,在美国原产地草原的染色体倍型中有二倍体、四倍体和六倍体三种,其中六倍体分布最广[13],五倍体野牛草在自然界不存在,为人工培育而成[14]。野牛草为异花授粉植物,雌雄多异株少同株;株丛高度一般在15～35 cm左右,叶片细软,长度可达10～30 cm,宽度约1～2 mm,整体呈绿色或灰绿色;雄花呈穗状花序排列成总状,于穗轴一侧分两排生长,单一穗轴上雄花小穗大概10个,长度约3～6 mm,整个花轴高出株丛约5～15 cm;雌花呈球状花序,花轴较植株株丛高度矮,每颗颖果包裹着1～5颗种子;匍匐茎发达,在充足光照下,能快速进行营养繁殖并覆盖土壤,对土壤要求较低,沙壤土以及轻度盐碱土均能较好适应[15];种子存在休眠机制,若进行种子繁殖,在进行处理后才能进行播种,一般在4—5月土壤温度适宜时进行播种;在华北地区返青期为4月下旬,枯黄期为10月下旬或11月上旬,绿期为180天左右[16]。

野牛草是禾本科野牛草属下唯一种,由于其抗旱属性被作为草坪草而被美国干旱地区广泛使用。我国曾于20世纪40年代在甘肃首先引种野牛草,后野牛草被当作生态修复草种和抗性草坪草在西北华北等地区广泛种植[17]。目前我国市场上使用的野牛草品种主要以美国进口品种为主,少量为自主培育品种。自上世纪以来我国各地培育了许多野牛草品系以及品种,但长期以来我国野牛草优良的种质资源尚未得到合理利用,大量优秀品系以及品种未得到保护,而UPOV以及我国均无野牛草的DUS测试指南。为了加快推进野牛草新品种保护工作,促进鼓励个人与企业对野牛草草种的育种和研发,制定适应我国的野牛草DUS测试指南势在必行。

1 材料与方法

1.1 研究材料

本试验测试品种为市场上部分野牛草商业品种、本课题组自主培育并申请注册的野牛草新品种以及山东莒县地区野牛草育种基地中无性繁殖培育多年的野牛草稳定品系(稳定品系来源于北美大草原不同地区野生种);总计56个材料,分别为8个进口商业品种、7个自主培育新品种以及41个多年稳定品系(品系名为数字加英文例如1-2c)。

1.2 测试方法

本试验在山东莒县野牛草育种基地(118.783 90° E,35.562 04° N)进行,采用单株种植方法,株行距5 cm,每个参试材料分别种植于4.0 m×2.0 m田间地块,所有材料均进行大田养护管理,于2021年和2022年两年间对参试野牛草材料的31个性状指标进行测试。每个个体观测的植株取样点为1个,取样数至少为10个;群体观测则应观测整个植株品种的群体表现。

野牛草物候期生育阶段表如表1,其中编号代表不同生育阶段;野牛草测试各性状名称类别以及测试方法和分级如表2,各性状均选取最适宜测试时期。

表1 野牛草属生育阶段表Table 1 List of growth stages of buffalo grass

表2 野牛草新品种DUS测试指南性状表Table 2 Characteristics table of DUS test guide for new buffalo grass varieties

1.3 分组性状的选择

选择“性别”“植株株高”“叶色泽”以及“种包千粒重”为分组性状,其中“植株株高”“种包千粒重”为数量性状,“性别”为质量性状,“叶色泽”为假质量性状。

1.4 标准品种的选择

标准品种原则上应该选择公知公用且较易获得的品种,这些品种应该通过特异性、一致性与稳定性的测试,每个品种尽可能代表多个性状。由于UPOV以及我国均无野牛草DUS测试指南,也无相关标准品种研究内容,因此本研究按照标准品种选择原则,从试验品种中选择11个品种作为标准品种,其中包括4个美国进口品种,7个自主培育品种(表3)。

表3 标准品种表Table 3 Standard varieties

1.5 数据统计与处理

利用SPSS 26.0进行数据处理分析,特异性的研究主要通过统计分析数量性状、质量性状以及假质量性状的变异系数,并通过聚类分析研究各性状的相关性;一致性的研究则计算各品种内和品种间的一致性比例,分析各性状的一致性情况;稳定性的分析则通过研究部分野牛草品种连续两年的表型性状的分布情况以及独立样本t检验。特异性与一致性的判断需要统计分析数量性状数据的方差(V)、标准差(S)和变异系数(CV),计算公式分别是:

(1)

(2)

(3)

2 结果与分析

2.1 DUS测试指南性状

DUS测试性状的选择应满足以下几点要求:性状容易被定义且能准确定义;品种间特异性强,能够有足够的差异进行分类鉴别;一致性与稳定性较强,能够稳定表达[18]。根据GB/T 19557.1《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》[19]以及GB 6142-2008《禾本科草种子质量分级》[20]对参试野牛草进行两个生长周期的测试。第一个生长周期选择31个测试性状,经过第二个周期的测试通过特异性、一致性与稳定性的分析最终选择了雄花序长度、匍匐茎花青苷显色等28个测试性状,其中必测性状24个,辅助测试性状4个;必测性状中数量性状13个,质量性状5个,假质量性状6个。从性状类别来看,数量性状所占比例为53.57%,可见数量性状是野牛草主要性状类型,是鉴定分类野牛草品种必不可少的判断依据;从性状选择部位来看,植株的性状、花部的性状、叶部的性状、匍匐茎的性状、果实的性状、物候期的性状分别为5个、9个、8个、3个、1个和2个,花部和叶部分别占比为32.14%和28.57%,花叶共同占比为60.71%,说明野牛草性状在花叶上呈现出较大差别,本测试指南也倾向于野牛草花叶性状的测试。

2.2 数量性状变异分析及分级

用SPSS 26.0统计并分析所测试野牛草材料的15个数量性状(表4),结果表明野牛草15个数量性状的变异系数处于11.66%～35.13%之间,说明野牛草各数量性状在各品种之间有较大的变异,数量性状具有品种分类的潜力。叶宽度和雄花序宽度变异系数较小,分别为11.66%和12.88%;而雌花高度变异系数最大,为35.13%。以往对野牛草的性状测试多局限于叶部性状,本试验花部性状除雄花高度外变异系数均较大,适用于品种间的分类鉴别,说明花部性状也是性状测试中不可缺少的。

表4 数量性状变异分析表Table 4 Variation analysis table of quantitative characteristics

表5 野牛草数量性状的分点值和对应代码Table 5 Suggested point values and corresponding codes for quantitative characteristics of buffalo grass

2.3 性状相关性分析

利用SPSS 26.0对野牛草雌雄株共有的必测性状进行相关性分析,从表6中可以看出,野牛草自然高度与叶长度呈极显著正相关关系(P<0.01),与叶宽度呈显著正相关关系(P<0.05),与叶色泽呈显著负相关关系(P<0.05);匍匐茎节间直径与叶宽度呈极显著正相关关系(P<0.01);叶长度与叶色泽呈显著负相关关系(P<0.05);上表皮茸毛与下表皮茸毛呈极显著正相关关系(P<0.01),与生长习性呈极显著负相关关系(P<0.01);下表皮茸毛与生长习性呈显著负相关关系(P<0.05);生长习性与叶质地呈显著负相关关系(P<0.05)。

其中上表皮茸毛与下表皮茸毛具有极强相关性(皮尔逊相关性大于0.800),是因为大部分野牛草都表达出上、下表皮茸毛性状;自然高度与叶长度、叶宽度具有较强相关性(皮尔逊相关性大于0.300),符合植株生长长高的自然规律;匍匐茎节间直径与叶宽度具有较强相关性(皮尔逊相关性大于0.300),是否与实际生产情况相符以及具体原因仍需要研究;生长习性与叶质地相关性较强(皮尔逊相关性大于0.300),且呈负相关关系,符合植株生长规律,叶片质地会影响草本植物的生长习性;上表皮茸毛与生长习性相关性较强(皮尔逊相关性大于0.300),可能是不同器官表现出的偶然现象;其他性状之间如自然高度与叶色泽等虽然表现出相关性但相关性不强。综上,野牛草性状除少部分具有相关性外大部分性状之间的相关性不强,各性状之间特异性较强,利于品种的鉴别与分类。

2.4 聚类分析

利用SPSS 26.0对所有雄性野牛草材料进行Q聚类分析,结果如图1所示;对所有雌性野牛草材料进行Q聚类分析,结果如图2所示。由图1可知,当相对距离为15的时候,30种雄性野牛草材料被聚为9大类,当相对距离为10的时候则有13个聚类节点出现,说明受试雄性野牛草材料之间相对独立,特异性较强便于材料间的分类。由图2可知,当相对距离为15的时候,26种雌性野牛草材料被聚为4大类,当相对距离为10的时候则有6个聚类节点出现。雌性野牛草测试性状少于雄性野牛草,其分类类别也相对较少,但其特异性仍然适用于品种间的分类。

图2 野牛草雌性品种Q型聚类分析结果Fig.2 Q-type cluster analysis results of female species of buffalo grass

3 讨论

野牛草自从上世纪40年代引进我国以来一直在我国园林绿化以及生态修复方面有着较为广泛的使用。作为一种常见的草坪草,以往对其表型性状方面的研究多集中于其整体植株特性以及坪用性方面[22],对其花叶研究较少,而通过本试验得知,野牛草花叶性状由于其特异性、一致性以及稳定性方面表现较好,是分类鉴别必不可少的性状,因此本测试指南加入其花叶性状,以期从一个较为全面的角度总结概括野牛草的表型性状,从而研制出DUS测试指南。目前暂无对野牛草DUS测试性状的相关研究,前期对野牛草表型性状方面的研究主要集中在种质资源方面,一般以植株性状以及叶部性状作为判定标准[23],而本研究野牛草新品种DUS测试指南包括测试性状、测试方法、测试时期以及各性状分级代码,其中测试性状包括植株的性状、花部的性状、叶部的性状、匍匐茎的性状、果实的性状、物候期的性状,表型性状描述较为全面。成凯凯等[24]以工具测试以及目测作为测试方法对30份野牛草种质资源进行了遗传多样性的统计分析,因此本测试指南中测试方法包括工具测试以及目测,尽量简化的测试方法有利于测试指南的推广以及增加实际操作的可行性[25];参考野牛草的物候期特征以及乔葭月等[26]在对野牛草种质资源的评价研究中测试期选择春夏时期,本研究中测试时期主要是集中在春夏两季野牛草开花结果时期,具体各性状测试时期均在表1标注。孙建军等[27]对紫云英DUS测试的研究以及蒋林峰等[28]对鸭茅DUS测试的研究表明植株物候期的差异对测试结果会造成影响,本研究中也发现由于各个野牛草植株的物候期稍有差异,在不同的物候期表型性状的表现又会有所区别,因此在实际操作过程需要测试人员根据实际情况灵活选择各个性状的测试时间。

目前UPOV与我国均无野牛草新品种DUS测试指南,本文首次研制出野牛草新品种DUS测试指南,可以为UPOV及其成员国的野牛草DUS测试指南的研制提供参考;有助于完善国内野牛草新品种DUS测试的内容,加快推进野牛草新品种保护工作,促进鼓励个人与企业对野牛草草种的育种和研发,为野牛草种质资源的合理利用与保护做出贡献;对野牛草表型性状的系统性研究以及对花叶等部位的全面统计研究为今后野牛草新品种数据库的建立提供了依据。