罗慧英，吴步梅，马天玥，张文利，方彩霞，魏永波，陈辅斌

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃兰州 730000；3.兰州市农业科技研究推广中心，甘肃兰州 730000；4.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京 211198；5.皋兰百璐通瓜果专业合作社，甘肃兰州 730200；6.什川镇农业农村综合服务中心，甘肃兰州 730200）

软儿梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）也叫冻梨、香水梨，是兰州特色水果。食用方法独特，具有后熟发酵及冻食特性。每年深秋采摘，新鲜果品口味欠佳，果肉硬而味酸，冷冻贮藏40 多天后，果皮变黑，果肉发酵软化，其品质不因褐变而受到影响，果糖含量增加，此时食用梨软如泥，浆液充盈，味甜似蜜，是中国地方梨品种中的一个特色品种。2015 年被农业部批准为“全国农产品地理标志”。兰州年产软儿梨3 万多吨，但是由于技术原因，除直接食用和简单加工后制成果汁、果酒外，未见高附加值的下游产品，资源浪费巨大，高值化、多品类的开发利用成为现今迫切需求。

咳嗽是呼吸道系统的常见病。中医认为“肺主宣发和肃降”，肺气宣发通畅，则能主一身之气而呼吸调匀，助血液循环而贯通百脉[1-2]。但肺为娇脏，最易受外邪侵袭，如果受到风、寒、暑、湿、燥、火六淫的侵袭，就会造成肺失宣降，肺气上逆，引起咳嗽。按病邪性质咳嗽可分为风寒咳嗽、风热咳嗽、风燥咳嗽，痰湿咳嗽等[3-6]。秋冬时节，由于气候干燥多燥邪或风邪犯肺引发咳嗽，治疗多以清热去燥；而内伤咳嗽，多以脏器功能的失调为基础，以痰湿、痰热、肝火犯肺，肺阴亏损等为主要病症，治疗多以滋阴润肺为主[7-9]。软儿梨性凉味甘，富含果酸、苹果酸、柠檬酸、蔗糖、葡萄糖等成分，具有清热解毒、润燥止咳，生津化痰、滋身祛疾之功效[10-11]，是药食兼备的妙品。《本草纲目》记载软儿梨有润肺、止咳、凉心消炎、降火、解疮毒、解酒等多种功效，当地人常服食之以镇咳化痰，但其具体作用机制鲜见报道。本研究旨在采用网络药理学方法和生物信息分析技术对软儿梨止咳化痰作用进行研究，并通过分子对接和动物实验对分析结果进行验证，以期为软儿梨止咳化痰功效提供理论与试验依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

中药系统药理学数据库（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、本草组鉴（http://herb.ac.cn）、ECTM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/）、STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、Metascape 分析平台（https://metascape.org/）、PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uiprot 数据库（https://www.uniprot.org/）、PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）、Cytoscape 3.6.1、Autodock Vina 2.1、Chem3D、Pymol 3.3、Venny 2.1.0 等。

1.2 材料与仪器

软儿梨冻梨 甘肃皋兰百璐通瓜果专业合作社提供，剥去表皮后自然解冻取汁1000 mL，相当于软儿梨冻梨1460.7 g，经高效液相色谱法测定，总酚含量为149.14 mg/kg、总黄酮含量为58.23 mg/kg[12]；SPF 级昆明小鼠 100 只，18～20 g，雌雄各半，甘肃中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0002，动物伦理审查批号：20 220714；麻杏止咳糖浆 太极集团四川南充制药有限公司，国药准字Z51 022042；氨水、酚红 青岛海湾精细化工有限公司；IL-6 ELISA 试剂盒、IL-13 ELISA 试剂盒 南京建成生物工程研究所；RT-PCR 试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、RNA 提取（Trizol 法）试剂盒 上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗IL6多克隆抗体、兔抗IL1B 多克隆抗体、兔抗MAPK3多克隆抗体、兔抗VEGFA 多克隆抗体、兔抗PTGS2 多克隆抗体 上海酶联生物科技有限公司。

UV-5500 型紫外分光光度计、BS124S 型电子天平、B-600 型超微量分光光度计 上海元析仪器有限公司；TDL-5M 型台式大容量低温离心机 上海精密仪器仪表有限公司；医用KJR-602C 型超声雾化器 合肥康居人智能科技有限公司；SUNRISE 酶联免疫检测仪 瑞士TECAN 公司；PCR 扩增仪、实时荧光定量PCR 仪 美国Applied Biosystem 公司；

1645050 型基础电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽、小型rans-Blot 转印槽 美国Bio-Rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析 通过调研，收集文献已报道的软儿梨化学成分，TCMSP、本草组鉴、ECTM 数据库中检索其对应的作用靶点。GeneCards 数据库中分别以关键词“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”检索，得到与咳嗽和生痰相关的两组基因。将GeneCards 数据库中所得两组基因与软儿梨的作用基因相映射，得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。Venny 2.1.0 绘制维恩图，Cytoscape 绘制软儿梨止咳化痰作用成分-靶点图。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至Metascape 数据分析平台，进行GO 功能富集分析（包括Biological process、Cellular component、Molecular function）和KEGG 通路富集分析。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至STRING 数据平台，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI 网络）。利用Cytoscape插件CytoHubba，根据Degree 值过滤出PPI 网络中的关键基因（Top10 基因）。通过Metascape 数据平台对Top10 基因进行KEGG 通路富集，预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。

1.3.2 软儿梨止咳化痰作用Top10 基因分子对接验证 Uiprot 数据库、PDB 数据库中检索下载Top10基因的蛋白结构，PubChem 数据库中下载PPI 网络中排名前3 位的化学成分3D 结构。采用Chem3D、Pymol 对受体和配体进行加氢、去水、均电荷等预处理，采用Autodock Vina 进行对接，设置对接20 次，采用Pymol 将结合能最小的对接结果可视化。

1.3.3 软儿梨止咳化痰作用动物试验验证

1.3.3.1 氨水引咳试验 SPF 级昆明种小鼠50 只，雌雄各半，体重18～20 g，随机分为5 组，分别为软儿梨高、中、低剂量组（软儿梨原汁0.2、0.15、0.1 mL/10 g），麻杏止咳糖浆（0.1 mL/10 g）为阳性对照组，生理盐水（0.1 mL/10 g）为空白对照组；每天灌胃给药1 次，连续10 d。于最后1 次给药1 h 后逐一将小鼠放入钟罩内，用医用超声雾化器以最大喷雾量（0.2 mL/min）向钟罩内喷入25%氨水气雾对小鼠进行引咳，15 s 后将小鼠移出，记录从开始喷雾到小鼠产生第一次咳嗽所需时间（咳嗽潜伏期）和3 min 内咳嗽次数[13]。小鼠典型咳嗽症状为：腹部内缩，同时张大口，有咳嗽声。并按公式计算止咳率。

1.3.3.2 酚红排泄试验 SPF 级昆明种小鼠50 只，雌雄各半，分组及给药方法同氨水引咳试验。末次给药30 min 后小鼠腹腔注射5%的酚红溶液0.5 mL（0.5 g/kg），30 min 后处死动物，剥离甲状软骨下至气管分叉处的气管，放入盛有2 mL 生理盐水的试管中，加入1 mol/L 的NaOH 0.1 mL 摇匀，于波长546 nm处测吸光度，根据标准曲线，计算酚红含量（μg/mL）[14]。

1.3.3.3 ELISA 法检测血清炎症因子水平 氨水引咳试验中的小鼠，记录咳嗽潜伏期和3 min 内咳嗽次数后，摘眼球取血，离心取血清，按ELISA 试剂盒说明测定血清中IL-6 和IL-13 含量。

1.3.3.4 RT-PCR 检测肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA 表达 氨水引咳试验中的小鼠，摘眼球取血后，处死动物，冰上取出肺脏，分成两份，-80 ℃冰箱保存，分别供逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹（WB）使用。取-80 ℃保存的肺组织50 mg，按试剂盒说明书提取收集RNA，将得到的RNA 溶于DEPC 水中；取溶解后的RNA 2 μL，微量分光光度计于260、280 nm 处测定吸光度，通过A260/A280 计算RNA 的纯度和浓度。通过逆转录试剂盒合成cDNA，NCBI Geneba（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Primer Bank（http://harvard.edu）搜索基因序列，根据基因序列设计引物（引物序列见表1），采用实时荧光定量PCR 扩增，每个样品做3 个复孔，扩增条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.3.3.5 Western Blot 检测肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 的蛋白表达 取适量-80 ℃保存的肝脏组织加入裂解液，8000 r/min，4 ℃低温匀浆10 min，冰上裂解20 min 后冻融3 次，低温离心10 min（8000 r/min，4 ℃），取上清，用5×上样缓冲液与蛋白样品按1:4 的比例混合，100 ℃变性5 min 后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，5%BSA 封闭1 h，一抗（1:1000 稀释）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL 发光液显影，Image J 软件分析目的蛋白与内参蛋白的灰度值，根据相应内参的灰度值计算目的蛋白的相对表达量。

1.4 数据处理

用SPSS 20.0 软件对所有数据进行处理，计量资料用+SD 表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果

经文献调研发现，软儿梨中已见报道的化学成分有51 个（表2），经TCMSP、本草组鉴、ECTM 数据库检索得到对应作用靶点282 个。GeneCards 数据库中与咳嗽相关的基因有4425 个，与生痰有关的基因有1737 个，三者映射重叠基因有80 个（图1a），软儿梨止咳化痰作用成分-靶点-疾病映射图见图1b。将80 个交集基因提交至Metascape 数据分析平台，得到KEGG 通路富集（图1c）和GO 功能富集（图1d）结果，如图可知，这80 个基因可能与细胞内过氧化物酶活性（Peroxidase activity）、抗氧化活性（Antioxidant activity）、氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、对活性氧的反应（Response to reactive oxygen species）等生物过程有关，机制可能涉及TNF 信号通路、IL-17信号通路、癌症信号通路等。通过STRING 数据库，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI 网络）（图1e）。利用Cytoscape 插件CytoHubba，根据Degree 值过滤出PPI 网络中的关键基因（Top10基因）（图1f），分别是：GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3。Top10 基因与软儿梨中所含化学成分对应关系如图1g 所示。对Top10 基因进行KEGG 通路富集分析，前20 条富集信号通路如图1h 所示，其中12 条信号通路与细菌、病毒及寄生虫感染有关（Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、PathogenicEscherichia coliinfection、Chagas disease、Human cytomegalovirus infection、Yersinia infection、Leishmaniasis、Salmonellainfection、Amoebiasis、Malaria、Legionellosis、Hepatitis B），4 条信号通路与免疫相关疾病有关（IL-17 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、Rheumatoid arthritis、Toll-like receptor signaling pathway）（见图1i），提示软儿梨可能主要通过消除炎症感染、增加人体免疫力来发挥止咳化痰作用。

表2 软儿梨化学成分表Table 2 Chemical composition table of Ruanerli

2.2 软儿梨止咳化痰作用Top10 基因分子对接结果

分子对接结果显示，软儿梨止咳化痰作用Top10基因与PPI 网络中排名前3 位的化学成分（咖啡酸、苦丁、戊醛）的结合能均小于-5 kcal/mol（见图2），说明受体与配体能够自发结合，且具有较强的结合活性[15]，部分分子对接结果见图3。

图2 软儿梨止咳化痰作用Top10 基因蛋白与Top3 活性成分结合能图Fig.2 Binding energy graph of Top10 gene proteins for the antitussive and expectorant effects of Ruanerli and Top3 active components

2.3 软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响

氨水是一种刺激性较强的化学物质，动物吸入氨水气雾后，可刺激呼吸道感受器，引起咳嗽[13]。由表3 可知，经氨水刺激后小鼠出现明显咳嗽反应。与空白组比较，软儿梨组小鼠咳嗽次数显著减少（P＜0.05），咳嗽潜伏期也有显著延长（P＜0.05），且作用呈剂量依赖性，提示软儿梨对氨水所致咳嗽有较好的抑制作用。

表3 软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响（n=10）Table 3 Effect of Ruanerli on cough response induced by ammonia in mice (n=10)

2.4 软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响

酚红是一种对人体无害的染料，经腹腔注射进入小鼠体内后可部分由呼吸道排泄，由祛痰作用的药物在使支气管分泌增加的同时，也使呼吸道黏膜的酚红排泄量增加，因此可由呼吸道酚红的排泄量间接推测药物的祛痰作用。在本实验中，酚红标准曲线为：Y=0.81048X-0.05511，r2=0.97959。经与标准曲线比对发现，与空白组比较软儿梨组酚红排泄量显著增加（P＜0.05），其呈显著剂量依赖性（P＜0.05）（见表4），提示软儿梨有促进支气管黏膜分泌（祛痰）的作用。

表4 软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响Table 4 Effect of Ruanerli on phenol red excretion in respiratory tract of mice

2.5 软儿梨对血清中炎症因子水平的影响

IL-6 是一个26 kDa 的多肽，生物效应极为广泛，主要包括[16-18]：调节B 细胞的生长和分化；增强CTL、NK 细胞的杀伤效应；刺激造血干细胞的增生分化；促进肝细胞合成急性相蛋白等。大量实验资料表明，IL-6 在维持机体生理平衡中具有十分重要的地位，体内IL-6 的异常与多种疾病有关。IL-13 是趋化因子家族的一种细胞因子，可诱导单核细胞分化和炎症反应，在过敏、哮喘、肺纤维化和肿瘤发生中具有重要作用[19-21]。在本实验中，经ELISA 检测发现，经氨水刺激后，小鼠血清中IL-6 和IL-13 的水平明显升高，经软儿梨处理后IL-6 和IL-13 的水平显著降低（P＜0.05），且作用呈显著剂量依赖性（P＜0.05）（表5），提示软儿梨可以降低血清中炎性介质的水平。

表5 软儿梨对小鼠血清中炎症因子水平的影响（n=10）Table 5 Effect of Ruanerli on serum levels of inflammatory factors in mice (n=10)

2.6 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA 表达及蛋白表达的影响

IL1 是趋化因子家族的一种细胞因子，IL1B 是其一种存在形式。低浓度的IL-1 主要发挥免疫调节作用[22-23]，主要表现在：a.与抗原协同作用，使CD4+T细胞活化，增加IL-2R 表达；b.促进B 细胞生长和分化，可使脾细胞的溶血空斑数（PFC）增加100 倍，说明IL-1 也可促进抗体的形成；c.促进单核巨噬细胞等的抗原递呈能力；d.与IL-2 或干扰素协同可以增强NK 细胞活性；e.吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；f.可刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应等。

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又称血管通透因子（Vascular permeability factor，VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，其作用主要包括[24-25]：a.促进内皮细胞增生。VEGF 是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生。尤其是在低氧环境下，VEGF 与内皮细胞膜上VEGF 受体结合，引起受体的自身磷酸化，从而激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK），实现VEGF的有丝分裂原特性，诱导内皮细胞增生；b.促进血管增生。在低氧环境下，VEGF 通过提高血浆酶原活化因子（PA）和血浆酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的mRNA 表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成；c.增加血管通透性。VEGF 是最强的可增加血管通透性的物质之一，该作用主要通过细胞小囊泡器来实现的，其特点是作用迅速、持续时间短。

前列腺素内过氧化物合成酶2（Prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2），又名环加氧酶2，只存在于一些特殊的细胞内，诱导、增强和传递疼痛及炎症信号[26-27]。

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，参与调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程[28-29]。MAPK3 是这个激酶家族的一员，可作用于多个信号级联，调节多种细胞过程，如增殖、分化和细胞周期进程，以响应各种细胞外信号[30-31]。

在本实验中，经RT-PCR 和Western blot 检测发现，经氨水刺激后，空白组小鼠肺组织中炎症相关基因（IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3）的mRNA水平和蛋白表达明显增加，提示炎症激活。软儿梨中、高剂量组可显著降低炎症基因的mRNA水平和蛋白表达（P＜0.05），且作用呈显著剂量依赖性（P＜0.05）（结果见表6、图4～图5），提示软儿梨可能通过抑制炎症相关基因的表达，进而降低血清中炎性介质含量，发挥止咳化痰作用。

图4 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA 表达的影响（n=10）Fig.4 Effect of Ruanerli on mRNA expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)

图5 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Ruanerli on expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 proteins in lung tissue

表6 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 蛋白表达的影响（n=10）Table 6 Effect of Ruanerli on protein expression of IL6,IL1B,VEGFA,PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)

3 结论

通过文献调研发现软儿梨中已见报道的化学成分有51 个，对应作用靶点282 个。与GeneCards 数据库中咳嗽和生痰相关基因映射后得到80 个软儿梨止咳化痰作用的相关基因。富集分析发现这80 个基因可能与细胞内过氧化物酶活性、抗氧化活性、氧化还原酶活性、对活性氧的反应等生物过程有关，机制可能涉及TNF 信号通路、IL-17 信号通路、癌症信号通路等。根据Dgree 值，从PPI 网络中筛选出了软儿梨止咳化痰作用的Top10 基因（GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3）。通过对Top10 基因进行KEGG 通路富集分析发现，在前20 条富集信号通路中12 条与细菌、病毒及寄生虫感染有关，4 条与免疫相关疾病有关，提示软儿梨可能主要通过消除炎症感染、增加人体免疫力来发挥止咳化痰作用。分子对接结果显示，软儿梨止咳化痰作用Top10 基因与PPI 网络中排名前3 位的化学成分（咖啡酸、芦丁、戊醛）可以自由结合，且具有较小的结合能。动物试验表明，软儿梨可以明显抑制小鼠氨水引发的咳嗽反应，增加小鼠气管酚红的排泄量，降低血清中炎性介质IL-6 和IL-13 水平；PCR 和WB 检测结果显示，软儿梨可显著降低炎症相关基因IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA 水平和蛋白表达，且作用与剂量成正比，这与生信分析结果相符，提示软儿梨的止咳化痰作用可能与降低炎性基因表达，减少致炎因子释放有关。由于客观条件限制，本文未对软儿梨止咳化痰作用做进一步的研究，其中涉及的深层机制还需要更深入的探讨。