陈仲春 苗变梁 谢幸巧 姚晋荣 赵霞

(1.复旦大学附属华山医院耳鼻咽喉头颈外科 上海 200040；2.复旦大学高分子科学系 上海 200438)

耳、鼻、咽喉和气管具有较多软骨，当因肿瘤、外伤等原因造成软骨缺损时，软骨重建对于维持器官功能和外形至关重要。由于软骨组织损伤后，自身再生修复能力非常有限，目前主要依靠自体软骨移植。但是用于软骨修复的自体移植物存在供区损伤、来源有限以及移植物力学强度不足等问题，因此寻找合适的替代物非常重要。组织工程化软骨是当前研究的方向。理想的组织工程化软骨支架应具备以下特征[1-2]：①优异的细胞相容性，即适宜的生长环境可以加速细胞增殖和分化；②适宜的机械性能，即组织形态的维持、细胞黏附和生长需要足够的机械支持；③无毒降解产物和可控生物降解性，生物材料降解留下的空间对再生组织的生长至关重要；④理想的可加工性。

近几十年来，各种新型支架材料不断涌现，但都存在不足，如以胶原、明胶、壳聚糖等为代表的天然可降解生物材料的生物相容性好但机械强度远远不够；以聚乳酸为代表的高分子可降解合成材料因其降解时产生的酸性代谢产物会导致局部非感染性炎症而影响组织修复[3]。

丝素蛋白(silk fibroin，SF)是一种天然生物材料，具有良好的生物相容性、机械性能和可控的降解速率[4]。SF 支架的三维多孔结构模拟了细胞外基质结构，为细胞黏附、生长和迁移提供机械支撑和具有营养的环境[5]。羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)作为天然骨组织的成分，具有优异的机械性能和生物相容性，能够对多种基本材料进行表面功能化，从而促进人骨髓间充质干细胞、软骨细胞的增殖和软骨的形成[6-8],SF 可以诱导HA 在表面沉积，并通过强有力的化学交联形成复合物[9]。有机物与无机物有序结合，矿物质含量的增加加强了丝素支架的机械性能。丝素HA 材料虽然已被广泛用于生物医学，但在耳、鼻、咽喉和气管软骨替代物方面的潜力仍未明了。

因此，本研究通过制作具有三维多孔结构的丝素HA 支架，观察软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖的情况，探讨多孔 3D 丝素HA 支架与软骨细胞的相容性，为组织工程软骨材料的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 丝素HA 支架的制作

将桑蚕茧放入质量分数0.5%碳酸钠的沸水溶液中煮30 min 以脱除丝胶，将脱胶丝置于9.5 mmol/L的溴化锂水溶液中，60 ℃溶解1 h，然后将所得溶液置于截流分子量为12～14 kDa 的透析袋中，用去离子水透析3 d 以除去盐。将透析好的丝蛋白溶液在8 000 r/min 下离心10 min，过滤，上清液用质量分数12.5%的聚乙二醇水溶液透析浓缩，得到质量分数约为14%的再生丝蛋白水溶液。在丝蛋白水溶液中加入氯化钙溶液，随后再加入磷酸氢二钠溶液继续混合。之后在37 ℃恒温水浴中培养24 h，即可得到丝蛋白/HA 复合悬浮液。逐滴加入正丁醇，室温下400 转/min 搅拌，形成稳定乳液。将正丁醇/丝蛋白/HA 复合乳液倒入模具中，在-20 ℃冰箱中冷冻24 h。室温下解冻，用去离子水漂洗除去正丁醇后，即得到SF-HA 复合多孔支架。

将支架切成小片后冷冻干燥，在液氮中脆断，喷金后在扫描电子显微镜下观察多孔支架断面的形貌。利用图像处理软件随机选择不少于50 个孔测量支架孔径，并计算平均值，结果以均数±标准差表示。采用液体置换法测量支架的孔隙率[10]。支架置于体积为V1 的正己烷溶剂中，使正己烷充分填充支架的孔隙后溶剂体积计为V2，将充满正己烷的支架取出后溶剂体积计为V3，支架的空隙体积为V1-V3，支架的总体积为V2-V3，支架的孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。共测试5 个样品，统计求得平均值。

1.2 人原代软骨细胞的分离培养和鉴定

取人鼻中隔矫正术后的鼻中隔软骨，立即浸泡在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GEMINI公司)的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养液(GIBCO 公司)中，用含1×105U/L 青霉素和100 U/L链霉素的生理盐水冲洗3 遍，再用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)冲洗3 遍，浸于含10%FBS 的DMEM 培养液中，用眼科剪剪成约1 mm×1 mm 大小，加入0.3%Ⅱ型胶原酶4 ℃消化过夜。100 目细胞筛过滤后将培养液离心1 000 r/min，5 min。弃上清，加入含10%FBS 的DMEM 培养液，一次性无菌吸管轻轻吹打混匀，置于25 cm2培养瓶中，37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养。每2～3 d 更换培养液。Ⅱ型胶原和亚甲蓝染色鉴定软骨细胞。

1.3 丝素HA 支架接种人原代软骨细胞

丝素HA 材料在75%乙醇中浸泡消毒，0.5 h 后取出，以PBS 清洗2 次，超净工作台内风干，平铺于24 孔塑料培养板底部。以1×105/mL 的密度将人软骨细胞接种到多孔SF-HA 复合支架上。加入含10%FBS 的DMEM 培养液，37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养。每2～3 d 更换培养液。

1.4 支架上软骨细胞的形态学观察

于软骨细胞接种支架第3、7、14 天后吸除培养液，细胞支架复合物以PBS 轻柔清洗2 次后，依次经过以下过程处理：①2.5%戊二醛4 ℃固定；②PBS 漂洗3 次；③1%锇酸固定；④PBS 漂洗3 次；⑤梯度乙醇脱水；⑥丙酮置换；⑦100%醋酸异戊酯置换；⑧临界点干燥，喷金；⑨扫描电镜(HITACHI SU8010)观察支架上细胞生长的情况，并用ImageJ 软件分析软骨细胞在丝素HA 支架上覆盖的面积。

1.5 支架上软骨细胞的活性观察

于软骨细胞接种支架第3、7、14 天后吸除培养液，细胞支架复合物以PBS 清洗2 次后，浸泡于20 μmol/L Calcein AM(sigma 公司)工作液中37 ℃孵育20 min。倒置相差荧光显微镜下(钙黄绿素染色)观察支架上细胞的生长情况。

1.6 支架上CCK8 软骨细胞增殖检测

培养1、3、7 d，将材料转移到新的48 孔板，在含有50 μL CCK-8溶液的200 μL培养基中培养3 h。之后将上清置于新的96 孔板，用分光光度计读取在450 nm 波长处的光密度值。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计软件，用ImageJ 软件分析人软骨细胞扫描电镜图片上细胞覆盖的面积，结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)；CCK-8 结果以均数±标准差表示，采用非参数Kruskal-WallisH检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丝素HA 支架

通过乳液冷冻制备丝素HA 复合多孔支架，可以定制为如图1A 所示管状，以满足临床气管的形状要求。支架具有多级的三维多孔结构，即除了三维连通的大孔之外，孔壁在微纳米尺度上出现纤维状网络结构(图1B)。支架的平均孔径为(54±22)μm，孔隙率为83%±1.6%。

图1 丝素HA 多孔支架 左图为外观；右图为微纳米尺度上显示显微网状结构。

2.2 人原代软骨细胞培养和鉴定

人原代软骨细胞培养24 h，可见部分细胞贴壁，细胞由圆形逐渐变成梭形或多角形；培养第2～3天，细胞开始分裂增殖；培养第7～9 天，细胞增殖加速。细胞Ⅱ型胶原和亚甲蓝染色阳性，鉴定为软骨细胞(图2)。

图2 人软骨细胞鉴定 A.Ⅱ型胶原染色；B.亚甲蓝染色。

2.3 支架上人原代软骨细胞生长的扫描电镜观察及统计

人原代软骨细胞可以在丝素HA 支架上生长、增殖，扫描电镜观察显示软骨细胞与支架黏附良好，细胞接种支架培养3 d 可见支架上细胞黏附增殖；7 d 后细胞在支架上增殖明显，覆盖更多支架表面并分泌基质；14 d 细胞铺满材料，并显示出层叠生长(图3)。统计显示，随着培养时间的增加，细胞数量增长，支架上细胞覆盖率也逐渐增大，3 d 时支架上细胞覆盖率约为70%，7、14 d 时支架上细胞分布面积大于3 d 的细胞分布面积，达到了90%以上，其中14 d 和3 d 的差别具有统计学意义(P＜ 0.01)。详见图4。

图3 人原代软骨细胞支架上生长扫描电镜观察 A.培养3 d；B.培养7 d；C.培养14 d。

图4 培养不同时间人原代软骨细胞支架上覆盖面积 **示P ＜ 0.01。

2.4 支架上人原代软骨细胞活性观察

人原代软骨细胞可以在丝素HA 支架上生长、增殖，钙黄绿素活细胞荧光染色显示软骨细胞具有良好的活性及形态；接种3 d 细胞可见增殖，7 d 后细胞增殖明显，14 d 细胞铺满材料并保持良好的形态及活性(图5)。

图5 人原代软骨细胞在丝素HA 支架材料上生长 A.培养3 d；B.培养7 d；C.培养14 d。

2.5 CCK8 细胞增殖检测

通过CCK-8 检测人软骨细胞在丝素HA 支架上的增殖情况发现，在培养的第1、3、7 天，细胞的增殖表现为随时间增加细胞数目增多，在3 个时间点之间的差异有统计学意义(图6)。

图6 培养不同时间人软骨细胞在支架上增殖 **示P ＜ 0.01。

3 讨论

种子细胞、基于生物材料支撑细胞生长和功能的基质以及细胞和组织的刺激诱导系统是组织工程的三大要素[11]。组织工程科学的研究基础和热点之一是选择合适的材料来构筑供细胞生长的支架，不仅要求支架材料本身具有良好的生物相容性，而且易于加工制作成高孔隙率、多孔结构特征可控的三维多孔结构[11-12]。通过不同的处理方法，丝素可形成多种结构，如纤维、薄膜、水凝胶和三维多孔结构，可促进成纤维细胞、软骨、间充质干细胞、上皮细胞等的生长[13-14]。本研究中通过乳液冷冻制备丝素HA 复合多孔支架的方法操作简便，可以通过模具制作成块状、管状等形状，样品可塑性高，能满足临床上多种形状要求。通过扫描电镜可观察到制作的支架具有相互连通的三维多孔结构和较高的孔隙率(83%±1.6%)。这种类似细胞基质的结构能够模拟生物体内的理化环境，可以提供适当的孔道和表面结构来引导和支持细胞的黏附、迁移、增殖和分化等，以及传送营养物质和输出代谢产物，从而进一步实现三维结构的组织再生和功能重建[15]。三维多孔结构亦有利于血管及组织的长入，实现支架材料与组织的整合。

SF 是一种可降解的天然高分子纤维蛋白质，具有良好的生物相容性，其降解产物主要为游离氨基酸等，可以通过蛋白水解酶反应易被人体吸收[16]。SF 因含有细胞结合结构域，利于细胞连接，能促进多种细胞的黏附及生长[17]。有研究[18-19]显示，与桑蚕丝素相比，源自非桑蚕丝(如柞蚕)的丝素蛋白含较多的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，更有利于软骨细胞的附着和增殖。然而，由于非桑蚕丝的固有氢键和疏水性，非桑蚕丝纤维较难加工[20]。此外，桑蚕丝来源广泛、最常用[21-22]，加工方法绿色环保[4]，易于工业化生产，所以本研究选用桑蚕SF 作为制作支架的成分。

支架材料能否与软骨细胞良好相容是选择人工软骨修复支架首先需要明确的问题。本研究选择原代鼻中隔软骨作为评价材料相容性的细胞来源。研究发现，人原代软骨细胞能迅速黏附在丝素HA 支架上，并且较快增殖，钙黄绿素活细胞染色显示细胞在2 周的观察期内都保持良好的活性。扫描电镜观察发现，在软骨细胞接种支架7 d 时，细胞已覆盖支架大部分表面，细胞之间连接紧密；到接种14 d，材料表面基本被软骨细胞完全覆盖，且细胞排列更加紧密并分泌基质形成一层细胞层。CCK-8 细胞增殖检测结果也显示：在培养的第1、3、7 天，随时间增加材料上细胞数目逐渐增多，而且这3 个时间点之间细胞增殖的差异有统计学意义。由此可见，软骨细胞与丝素HA 支架在体外表现出良好的组织相容性。

鼻中隔软骨易于获得，分离的软骨细胞在体外培养至第2 代，细胞数量即可扩增至4 倍。体外培养4 代以内，可以保持细胞表型不变[23]。鼻中隔软骨是组织工程化软骨研究中重要的种子细胞来源[24]。鼻中隔软骨细胞具有较好的增殖能力。但是原代细胞不可避免地面临组织来源和扩增能力有限的问题，可诱导分化为软骨细胞的干细胞是有希望的组织工程化软骨的来源。

综上所述，SF-HA 支架易于加工，可以形成三维多孔结构，能够促进原代软骨细胞粘附、生长和增殖，可以考虑其作为潜在的组织工程化软骨支架材料进行进一步研究。目前的研究仅仅是材料体外细胞相容性的观察，未来的研究还需要完善相关的动物实验以明确材料的机械性能、降解过程以及与组织的整合能力等，以提供进一步的实验数据。