冯成敏 张西 邓启成 刘海

(川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科 南充 637000)

喉鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。尽管目前早期喉癌的治疗令人满意，但晚期喉癌患者的预后并不理想，5 年总生存率约为64.2%[1-3]。因此，从分子水平研究喉鳞癌的发生、发展机制，寻找作为早期诊断、预后评估及免疫治疗新靶点的分子标记物显得十分重要。MUC13 是黏蛋白(MUC)家族中的一种，编码跨膜蛋白MUC13 的基因位于染色体3q13.3。MUC13 具有所有黏蛋白都具有的串联重复结构域，为糖基的构建提供支架，含3 个表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)样结构域及一个参与细胞信号转导的胞质内结构域[4]。MUC13在卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、结肠癌等肿瘤细胞中异常表达促进肿瘤的生长及转移。MUC13 在喉癌进展中的作用尚罕见报道。本研究主要聚焦于MUC13 表达对喉鳞癌细胞生物学行为的影响，以探究MUC13 作为喉鳞癌诊断治疗新靶标的可能性。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

人喉鳞状细胞癌TU177 细胞株购自上海雅吉生物科技有限公司。RPMI-1640 培养基购自美国HyClone 公司，胎牛血清购自美国GIBCO 公司，胰酶、青霉素-链霉素双抗、PBS 缓冲溶液购自美国HyClone 公 司。MUC13siRNAs 片 段、Negative siRNA 片段、MUC13RNAi 慢病毒、NC 慢病毒、病毒助转染试剂HitransG P 购自武汉四维加生物公司。RiboFECTTMCP 转染试剂购自广州锐博生物科技有限公司，嘌呤霉素购自北京索莱宝科技有限公司。TRNzolUniversal 总RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 购自大连TaKaRa 公司，MUC13、GAPDH 上下游引物购自上海生工。Anti-MUC13 抗体(ab235450)购自英国Abcam 公司，羊驼抗兔IgG-HRP 二抗、山羊抗兔IgG H&L 红色荧光二抗购自杭州华安生物技术有限公司。Hoechst 33258 染色液、细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Transwell 小室购自美国Millipore 公司，Matrigel 基质胶购自美国Corning 公司，细胞周期检测试剂盒购自江苏凯基生物公司，凋亡检测试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司。

主要仪器：荧光定量PCR 仪(Roche Diagnostics,瑞士)，水平电泳系统(BD,美国)，流式细胞仪(Bio-Rad,美国)，SDS-PAGE 电泳仪(Bio-Rad,美国)，酶标仪(Bio-Rad,美国)，化学发光成像仪器(Bio-Rad,美国)，荧光倒置显微镜(Leica,德国)，激光共聚焦显微镜(Olympus,日本)。

1.2 方法

1.2.1 LV-MUC13-RNAi 转染TU177 喉癌细胞株及稳转细胞株构建

实验分组：①空白组，未经转染的TU177 细胞；②阴性对照组(NC 组)，随机SiRNA 序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，NC-RNAi 慢 病毒转染的TU177 细胞株；③实验组，SiRNA 序列为5'-CTCAGCTGATGCTGTAACA-3'[5]，MUC13-RNAi慢病毒转染的TU177 细胞株。

1)感染复数(multiplicity of infection，MOI)值的确定。将TU177 喉癌细胞接种在含有10%胎牛血清RPMI-1640 的培养皿，置于37 ℃、5% CO2的恒饱和湿度培养箱培养，取对数生长期细胞行MUC13-RNAi、NC-RNAi 慢病毒转染，确定MOI 值。

2)慢病毒转染后TU177 稳转细胞株的构建。将处于对数生长期的TU177 细胞按照5×104个/孔的密度接种于24 孔板，24 h 后细胞密度达40%～60%时进行转染。转染72 h 后在荧光显微镜下观察转染效果；同时加入含2 μg/mL Puromycin的RIPM1460 培养基继续培养，每天观察细胞状态，适时更换含2 μg/mL 的Puromycin 培养基继续培养。持续药物筛选，直到对照组细胞完全死亡为止。

3)LV-MUC13-RNAi 转染TU177 细胞后，细胞MUC13 敲低情况的鉴定。实时荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测3 组细胞MUC13 表达情况，提取细胞总RNA，测定细胞总RNA 量及完整性，总RNA 质量鉴定合格后，反转录为cDNA 立即进行RT-qPCR检测，引物序列见表1。反应条件见表2。反应结束后，分析RT-qPCR 的扩增曲线，观察熔解曲线，按每个反应的Ct 值，采用2-ΔΔCT 法进行相对定量分析，每组细胞重复实验3 次，取平均值进行统计分析。

表1 引物序列

表2 RT-qPCR 测试反应条件

4)蛋白印迹法(Western blotting)检测3 组细胞MUC13 蛋白的表达情况。取对数生长期细胞，BCA法测定蛋白总浓度，每个样品总蛋白溶液加入5×上样缓冲液,涡旋混匀，98 ℃加热10 min，使蛋白变性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，待浓缩胶完全聚合后，将其固定于玻璃板封闭架上，放入电泳槽中，封闭架内外加满1×Tris 甘氨酸电泳缓冲液。在加样孔内加入标准蛋白Maker 及待检总蛋白后，开始恒压电泳。待条带到达玻璃板底部时结束电泳，转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭1 h，将封闭后的PVDF 膜装入杂交袋中4 ℃孵育过夜，二抗中孵育1 h。将PVDF 膜平铺于暗盒的保鲜膜上，均匀滴加新鲜配制的ECL 混合溶液到PVDF 膜的蛋白面侧，发光检测显影、定影、凉片。将胶片进行扫描存档，用Image J 软件分析目标带的灰度值。每组细胞重复实验3 次，目标条带灰度值取平均值进行统计分析。

5)免疫荧光法确定3 组细胞MUC13 蛋白表达情况及表达位置。3 组TU177 细胞按5×104个/孔接种于激光共聚焦皿,每组3 个复孔；铺板24 h 后，4%多聚甲醛固定，甲醇通透5 min(-20 ℃预冷)，0.1%TritonΧ-100-PBS 通透5 min，山羊血清封闭1 h，孵育一抗，4 ℃孵育过夜(12 h 以上)弃一抗，室温避光孵育带有红光的荧光二抗1 h，用Hoechst33258复染细胞核，室温避光放置5 min，激光共聚焦显微镜拍照检查3 组细胞MUC13 表达情况及表达部位。

1.2.2 LV-MUC13-RNAi 转染TU177 细胞后检测细胞生物学行为变化

1)CCK-8 检测TU177 细胞活力及对5-氟尿嘧啶细胞毒性。将3 组细胞以5×103个/孔接种于96孔板，每孔RIPM1640 完全培养基体积为100 μL，每组6 个复孔，5-氟尿嘧啶细胞毒性实验组还需加入5-氟尿嘧啶61.9 μg/mL。各组分别在铺板后24 h、48 h、72 h、96 h 于生物安全柜内每孔加入10 μL CCK-8 试剂放入5%CO2、37 ℃培养箱孵育1 h。用酶标仪测定450 nm 波长处的OD 值，并根据吸光度值分析细胞增殖情况。

2)平板克隆实验检测TU177 细胞增殖能力和细胞群体依赖性。取3 组对数生长期细胞，以400 个/孔密度接种于6 孔板中(每组3 个复孔)，每孔培养基体积1.5 mL，混匀。放入5%CO2、37 ℃培养箱中培养14 d。6 孔板中出现肉眼可见细胞团后，终止培养，PBS 浸洗3 次，每次5 min，每孔用1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液后，PBS 浸洗3次；每孔1 mL 结晶紫染液染色20 min，超纯水洗去结晶紫染液，空气干燥。用扫描仪采集图像，肉眼直接计数各组克隆数，计算各组细胞克隆形成率(克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%)。

3)Transwell 小室实验检测喉癌细胞迁移能力及侵袭能力。迁移能力检测：3 组细胞均在实验前用无血清培养基培养12 h，Transwell 小室放入24 孔培养板中(每组3 个复孔)，每小室加入200 μL 细胞悬液(2.5×105个/mL)，在小室外加入600 μL 含10%血清的RPMI-1640 完全培养基，使小室内外室液面高度保持一致。37 ℃、5% CO2中培养24 h。培养24后取出Transwell 小室，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色20 min，用倒置显微镜在200 倍光镜下取上、下、左、右和中心5 个视野拍照，并统计各组迁移到小室膜背面的喉癌细胞数，计算平均值。该实验重复3 次。

侵袭能力检测。基质胶包被Transwell 小室：用无血清RPMI-1640 培养基稀释基质胶(稀释后基质胶浓度为300 μg/mL)，每孔100 μL 基质胶包被Transwell 小室，置于37℃、5% CO2培养箱，放置3 h 后把小室内培养基移除。步骤同Transwell 迁移实验，侵袭实验在37 ℃、5% CO2中培养48 h 后固定、染色、拍照、计数。

4)流式细胞术检测细胞周期及凋亡。取出3 组细胞培养皿，小心吸出旧培养液，用2 mL PBS 清洗，吸出PBS，加入不含 EDTA 的胰蛋白酶液消化细胞。调节细胞数为106/mL(据最终上机体积计算)，800×g离心 5 min。离心后的细胞进行细胞周期检测及凋亡检测(Annexing-V-Pacific BlueTM、碘化丙啶染色)每组细胞设置3 组重复对照。

1.3 统计学处理

结果数据采用IBM SPSS Statistics 25 统计软件进行单因素方差分析(NOVA),P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LV-MUC13-RNAi 转染TU177 喉癌细胞株及稳转细胞株构建

不同MOI 值病毒转染TU177 细胞株的情况如图1 所示，MOI 值为50 时，转染率可达90%以上，故确定NC-RNAi 病毒及MUC13-RNAi 病毒以50 的MOI 值转染TU177 细胞进行稳定转染细胞株筛选。筛选出稳定转染的细胞株进行后续细胞生物学行为研究。

图1 病毒转染TU177 细胞72 h 后荧光显微镜图像 A.不同MOI 值NC-RNAi 病毒转染TU177 细胞72 h 后荧光显微镜图像；B.不同MOI 值MUC13-RNAi 病毒转染TU177 细胞72 h 后荧光显微镜图像。

2.2 转染后细胞MUC13 表达沉默情况鉴定

TU177 细胞NC-RNAi 及MUC13-RNAi 病毒稳定转染株MUC13mRNA 及MUC13 蛋白质表达情况如图2 所示。图2A 表明，与空白组及NC 组相比，实验组细胞MUC13 mRNA 的表达显著降低。NC 组细胞MUC13 mRNA 的表达高于空白组可能是由于MUC 具有调控细胞周围微环境如pH、离子强度等的功能，作为载体的病毒及转染试剂在一定程度上改变了喉癌细胞的微环境从而刺激了MUC13 的高表达[7]。图2B 显示，与空白组及NC 组相比，实验组细胞MUC13 蛋白表达显著降低。MUC13 免疫荧光(图2C)实验结果显示实验组细胞的红色荧光强度显著降低，即与其他2 组细胞相比MUC13 蛋白表达水平显著降低，这与PCR 及Western blotting 结果一致。以上表明，MUC13-RNAi 病毒转染显著阻低了TU177 细胞的MUC13 蛋白质表达量。

2.3 LV-MUC13-RNAi 转染TU177 细胞后检测细胞生物学行为变化

2.3.1 LV-MUC13-RNAi 阻低MUC13 表达对TU177细胞活力及5-氟尿嘧啶细胞毒性的影响

采用CCK-8 法检测TU177 细胞活力及增殖能力(阻低MUC13 表达对喉癌细胞活力的影响)。采用CCK-8 法检测空白组、NC 组及实验组在不同时间点(6、24、48 h)TU177 细胞的细胞活力，结果如图3A所示。阻低MUC13表达显著降低了TU177细胞活力，其中24～48 h 实验组细胞活力较空白组和NC 组显著下降，由此说明抑制MUC13 表达可以抑制喉癌细胞TU177 的细增殖能力。此外，由图3B 可知，5-氟尿嘧啶不同程度上抑制了空白组、NC 组及实验组TU177 细胞的增殖，但48 h 后对实验组TU177 细胞增殖的抑制作用更加显著，表明阻低MUC13 表达提高了化疗药物5-氟尿嘧啶对TU177 细胞的细胞毒性。

2.3.2 平板克隆形成实验检测TU177 细胞增殖能力

由图4 可见，NC 组较空白组相对克隆形成率为78.9%，实验组较空白组相对克隆形成率为54.1%，实验组克隆形成率显著低于空白组及NC 组，差异有统计学意义(P＜0.05)。可见MUC13 蛋白表达阻低后喉癌细胞TU177 的细胞增殖能力降低。

图4 平板克隆实验检测TU177 细胞增殖能力和细胞群体依赖性 ＊表示P＜0.05。

2.3.3 Transwell 小室实验检测喉癌细胞迁移能力及侵袭能力

Transwell 小室迁移实验检测铺板24 h 后，小室上室内的3 组喉癌细胞穿过小室聚碳酸酯膜的细胞数，结果如图5A 示，NC 组与空白组比较，喉癌细胞相对迁移率为94.5%，差异无统计学意义(P＞0.05)；实验组与对照组相比，喉癌细胞相对迁移率为53.2%，实验组与NC 组相比，喉癌细胞相对迁移率为56.3%，差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。

图5 Transwell 小室实验检测喉癌细胞迁移能力及侵袭能力 A.MUC13 表达阻低后喉癌细胞的迁移能力降低；B.MUC13 表达阻低后喉癌细胞的侵袭能力降低。病理图片为光学显微镜下 ×200。*示P＜0.05。

Transwell 小室迁侵袭实验中，小室的聚碳酸酯膜上包被Matrigel 基质胶，这与天然基质膜结构相似，形成类似于细胞外基质的屏障，细胞不能自由通过，需分泌基质金属蛋白酶(MMPs)才能使基质胶降解，从而通过细胞变形运动穿过小室。此实验检测铺板48 h 后，小室上室内的3 组喉癌细胞穿过了包被Matrigel 基质胶的聚碳酸酯膜细胞数，结果如图5B 示，NC 组与空白组比较喉癌细胞相对迁移率为95.2%，差异无统计学意义(P＞0.05)；实验组与NC 组相比喉癌细胞相对迁移率为65.9%，实验组与NC 组比癌细胞相对迁移率为69.2%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，Tanswell 小室实验提示MUC13表达下调显著降低了喉癌细胞的迁移和侵袭能力。

2.3.4 流式细胞术检测细胞周期及凋亡

流式细胞术检测MUC13 表达阻低后对喉癌细胞周期的影响(图6A)，G1%/(G2%+S%)被用来表征各组细胞的增殖状态，与对照组相比，NC 组和实验组的G1%/(G2%+S%)值显著升高，其中实验组升高最为明显，这表明NC 组和实验组的细胞增殖受到抑制(G1 阻滞)[8]。MUC13 表达阻低后对喉癌细胞凋亡的影响结果如图6B 所示。结果表明：空白组凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)为8.21%，NC组为9.14%，实验组为12.71%。NC 组较空白组凋亡率略增加，差异无统计学意义(P＞0.05)；实验组喉癌细胞凋亡率较空白组及NC 组显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图6 MUC13 表达阻低后喉癌细胞细胞周期和凋亡率变化 A.细胞周期；B.凋亡率。

3 讨论

黏蛋白是由黏膜组织分泌的高分子量糖基化蛋白，正常情况黏蛋白位于黏膜表面，是防御病原体和不溶性微粒的主要屏障。MUC13 是黏蛋白中具有多种生理功能的一种跨膜蛋白。病理情况下MUC13通常会表现出异常表达，并参与炎症和肿瘤的发生、发展。MUC13 在多种恶性肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌、食管癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、黑色素瘤等组织中的转录和蛋白表达均明显高于癌旁组织，因此其可作为肿瘤诊断和治疗的一个潜在靶分子[9-13]。本文主要研究MUC13 表达对喉鳞癌细胞生物学特性的影响。

为了确定MUC13 表达对喉鳞癌细胞生物学特性的影响，我们采用慢病毒转染法得到MUC13 表达阻低的喉鳞癌TU177 稳定转染株。从图1 可知，以50 的 MOI 值转染 TU177 细胞时，转染效率较高，然而图2A 显示的MUC13 蛋白敲低效率并不及转染效率，可能与MUC 本身的生物学功能相关，MUC位于细胞表面，是防御病原体和不溶性微粒的主要屏障。在本研究中，我们采用慢病毒携带RNAi 序列转染喉癌细胞得到MUC13 表达阻低的TU177 细胞株，推断病毒转染的过程可能刺激MUC13 的表达升高。据文献报道，病原体如细菌、病毒等可刺激MUC 高表达，如张梦雯等[14]以腺病毒Ad5 和Ad7感染呼吸道A549 上皮细胞，发现腺病毒Ad5 可刺激A549 细胞MUC1 的表达升高 。而图2A 中，NC组MUC13 RNA 的表达水平比空白组高，也在一定程度上反映了可能是病毒转染造成MUC13 表达出现升高。病毒刺激使MUC13 表达基数增加，所以尽管转染效率不低，但与空白组相比，实验组细胞的MUC13 表达阻低与转染效率不一致。

与未经转染的空白组细胞及无意义序列病毒转染的NC 对照组细胞相比，MUC13 表达阻低的实验组喉癌细胞的增殖、化疗药物5-氟尿嘧啶对喉癌细胞的细胞毒性、喉癌细胞迁移、侵袭、周期及凋亡行为均发生一定程度的改变。实验组喉癌细胞CCK-8 检测OD 值随培养时间的变化率下降，相对克隆形成率显著下降，表明MUC13 表达阻低后TU177 细胞的细胞活力及增殖受到了限制。这与Sheng等[15]得出的MUC13 促进结直肠癌早期上皮细胞增殖的结论是一致的。同时，他们的研究表明MUC13 是通过促进NF-κB 的激活和下游靶基因的转录调控抗凋亡基因和促进生存基因的表达，从而抑制外源性和内源性细胞死亡途径。在外源性细胞死亡途径中，由于人类结直肠癌和一些结直肠癌细胞系中MUC13 过表达而肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)低表达，MUC13与TNFR1 结合增加了TNFR1 信号复合物的聚集，从而放大了TNF 诱导的信号转导效率。在内源性细胞死亡途径中，结肠细胞中也需要MUC13 来激活NF-κB。因此，我们推断MUC13 对喉鳞癌细胞增殖的促进作用也是通过类似途径实现的。5-氟尿嘧啶对MUC13 表达阻低后的TU177 细胞的细胞毒性增加与黏蛋白的结构与功能相关。Hollingsworth等[7]指出MUC 多价串联重复序列及复杂的层状结构可以促进分子进入与排除细胞从而帮助肿瘤形成分子屏障对抗有毒物质进入细胞如酸、细胞毒物及化疗药物等。实验组喉癌细胞的迁移和侵袭能力下降，表明MUC13 与喉癌细胞的侵袭及迁移能力相关。Khan等[16]研究MUC13 对胰腺导管癌细胞迁移及侵袭能力的影响，结果显示MUC13 促进胰腺导管腺癌细胞骨架重塑、细胞侵袭和迁移。这一作用与MUC13 对HER-2 及其下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)及黏附斑激酶(FAK)的诱导活化相关。Gupta等[17]以结直肠癌细胞 (SW480)为研究对象也得出相似的结论。流式细胞术检测表明MUC13RNAi 组喉癌细胞发生轻微G1 期阻滞及凋亡倾向增加，G1 阻滞表明细胞的增殖受到限制，且细胞凋亡倾向增加均表明MUC13 的阻低限制了TU177 喉鳞癌细胞的增殖，这也印证了之前CCK-8 测试及细胞克隆实验的结果。

以上研究表明MUC13 阻低可抑制喉鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭、增加了5-氟尿嘧啶对喉鳞癌细胞的细胞毒性，换言之MUC13 的存在可能促进喉鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，减弱5-氟尿嘧啶对喉鳞癌细胞的细胞毒性。故随着对MUC13 的进一步研究，其很有可能成为喉鳞癌治疗的新的靶标。