董李雅,吴永泰,婺鸣,李琳,张霞,3,4,李冰,3,4*

1(华南理工大学 食品科学与工程学院,广东 广州,510640)2(东莞理工学院,广东 东莞,523000)3(华南理工大学 广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室,广东 广州,510640)4(华南理工大学 淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心,广东 广州,510640)

烘焙是一种传统的食品热加工方法,近几年,面包、蛋糕、糕点等烘焙食品兼具正餐主食和休闲零食属性,在人们现代生活的饮食结构中占据了重要的位置,我国烘焙食品行业市场规模2020年已高达约2 400亿元[1]。烘焙食品一般含油量较高,油脂在保证良好的口感、风味和外观上起到了关键的作用,但在高温条件下也会产生对人体有害的物质,如单氯丙醇酯和缩水甘油酯。有数据显示,我国各地市售焙烤食品中氯丙醇酯污染普遍存在[2-6],其中,云南省境内随机抽样发现面包和饼干中单氯丙醇酯检出率分别为47%和27%[2],江西省市售面包中3-氯丙醇酯检出率达77.8%[6],2～12岁儿童组饼干、糕点暴露水平均高于2016年欧盟食品安全局对婴幼儿及儿童摄入3-MCPD最大耐受评估值0.8 μg/kg·d[3],而缩水甘油酯通常会与3-氯丙醇酯一起存在[7]。

单氯丙醇酯(esters of monochloropropanediol, MCPD酯)包括3-氯-1,2-丙二醇酯(esters of 3-monochloro-1,2-propanediol, 3-MCPD酯)和2-氯-1,3-丙二醇酯(esters of 2-monochloro-1,3-propanediol, 2-MCPD酯),其中3-MCPD酯的水解产物3-MCPD在氯丙醇类物质中毒性相对明确,世界卫生组织国际癌症研究机构(International agency for Research on Cancer, IARC)已在2011年将3-MCPD归为2B类,3-MCPD酯可通过在体内水解释放出游离的3-MCPD而产生肾毒性、生殖毒性、肝毒性和潜在致癌性。食品加工过程中3-MCPD酯的生成与降解反应同时存在。目前普遍接受的3-MCPD酯生成机理推测主要有4种:氯离子的直接亲核取代机理[8]、环酰氧鎓离子中间体机理[8-9]、自由基中间体机理[10-11]及缩水甘油酯机理[12-13];3-MCPD酯可能的降解途径也有3种[14],包括异构化、脱酰化和脱氯反应,其中异构化反应会将3-MCPD酯转换成2-MCPD酯,仍存在毒性作用。缩水甘油酯(glycidyl esters, GEs)也是油脂在高温条件下产生的一种潜在致癌物,其水解产物缩水甘油被证明具有致癌和遗传毒性,并于2000年被IARC归为2A类。GEs与3-MCPD酯有着相似的结构,两者生成机理密不可分,在一定条件下可能相互转换,因此在对MCPD酯开展研究的同时往往也会监测GEs的含量。

目前有关油脂精炼过程或煎炸过程中3-MCPD酯的形成规律的研究已逐渐深入,但含油量较高的烘焙食品在加工过程中MCPD酯和GEs生成规律的研究仍相对缺乏。另外,蛋白也是烘焙食品的重要组成部分,由于其同时含有亲水和亲油基团,在食品体系中起到乳化的作用[15],蛋白也可能影响MCPD酯的生成[16],因此,本研究基于蛋糕的配方,在油、水和NaCl的基础体系中添加了酪蛋白,建立烘焙模拟体系,监测了不同温度条件下MCPD酯和GEs的变化规律,探究了油水比的影响,改变烘焙模拟体系中油脂的种类(菜籽油、玉米油和椰子油)研究MCPD酯和GEs含量变化规律的差异,此外,分析了MCPD酯和GEs含量变化与油脂氧化程度变化的相关性,探讨油脂氧化对体系中MCPD酯和GEs生成的影响机制,为控制烘焙过程中MCPD酯和GEs的生成提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

压榨一级菜籽油,道道全粮油股份有限公司;压榨一级玉米油,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;椰子油,上海麦克林生化科技有限公司;酪蛋白,美国Sigma-Aldrich公司。

苯硼酸(phenylboronic acid, PBA)纯度97%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;四氢呋喃(tetrahydrofuran, THF)、甲苯、正庚烷、正己烷、甲醇(均为色谱纯),上海易恩化学技术有限公司;NaCl、NaBr、NaHCO3、Na2SO4、KOH(均为分析纯),天津市大茂化学试剂厂;标准品:3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸二酯-d5(1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol-d5,PP-3-MCPD-d5),纯度>98%,加拿大CDN isotopes公司;3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸二酯(1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol,PP-3-MCPD)、2-氯-1,3-丙二醇棕榈酸二酯(1,3-dipalmitoyl-2-chloropropanediol,PP-2-MCPD)、棕榈酸缩水甘油酯-d5(glycidyl palmitate-d5,Gly-P-d5)、棕榈酸缩水甘油酯(glycidyl palmitate,Gly-P)(纯度均>98%),加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 8890-7000D三重串联四极杆气相色谱质谱联用仪,美国安捷伦科技公司;Carry 50 Conc紫外分光光度计,美国Varian公司;HWCL-5油浴锅,郑州长城科工贸有限公司;RV 10 auto FLEX旋转蒸发仪,德国IKA公司;MD200-2氮吹仪,杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 烘焙模拟体系的制备

(1)不同加热温度的烘焙模拟体系

基于芝士蛋糕配方,保留油、水、NaCl、酪蛋白等主要组分建立烘焙模拟体系:称量玉米油2.0 g、酪蛋白0.05 g和0.1 g/mL的NaCl溶液5 mL于耐压管中,加入磁力搅拌转子混合均匀,分别在160、180、200 ℃油浴搅拌加热5、10、15、20、30 min,待加热结束迅速冰水浴冷却。用20 mL正己烷分离提取油脂部分,采用旋转蒸发和N2吹扫除去溶剂,样品保存于4 ℃。

(2)不同油水比的烘焙模拟体系

控制体系总质量不变,改变油与水的质量比分别为1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1,于200 ℃下搅拌加热30 min,其余操作均同(1)。

(3)不同油脂的烘焙模拟体系

分别选用菜籽油、玉米油和椰子油制备烘焙模拟体系,加热温度为200 ℃,其余操作均同(1)。

1.3.2 单氯丙醇酯和缩水甘油酯的测定

样品前处理:参考国际标准ISO 18363-3—2017及李昌[13]的方法并作适当修改。精确称取样品(115±5) mg,分别加入50 μL的PP-3-MCPD-d5(40 μg/mL)和Gly-P-d5(50 μg/mL)作为内标。加入2 mL THF溶解样品,加入30 μL的3 mg/mL NaBr酸性水溶液混匀,50 ℃水浴孵化15 min,将缩水甘油酯转化为3-溴-1,2-丙二醇(3-monobromopropanediol,3-MBPD)酯;用3 mL 6 g/L NaHCO3溶液停止反应后,加入2 mL正庚烷混合,提取上层有机相,40 ℃下N2吹扫约15 min除去溶剂,用1 mL THF复溶,加入1.8 mL的硫酸甲醇溶液混合均匀,置于40 ℃水浴孵育16 h进行酯交换反应;用0.5 mL的0.1 g/mL NaHCO3溶液停止反应,氮吹15 min,加入2 mL 20% Na2SO4溶液,分别2次用2 mL的正庚烷除去脂肪酸甲酯;加入250 μL的250 g/L PBA丙酮水溶液,超声5 min进行衍生化,用1 mL正庚烷提取衍生物2次,氮吹5～10 min,最后加入400 μL正庚烷溶解,过0.22 μm有机膜后转移至带有200 μL内插管的样品瓶中,后续进行GC-MS测定,采用内标-标准曲线法定量,含量以相应的游离态(氯丙醇和缩水甘油)计,单位以mg/kg样品表示。

气相色谱条件:色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm);进样量1.0 μL,不分流,进样温度280 ℃;溶剂延迟5 min;载气为He,1 mL/min;采用程序升温,初始温度80 ℃保持1 min,以10 ℃/min升至160 ℃后保持3 min,再以3 ℃/min升至180 ℃,以20 ℃/min升至300 ℃并保持5 min。

质谱条件:电离源为电子轰击(electron impact ion,EI)源,电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;传输线温度280 ℃;单离子检测扫描模式(single ion monitoring,SIM),参数设置如表1所示。

表1 SIM监测离子参数Table 1 Monitoring parameters of SIM

1.3.3 脂肪酸组成的测定

参考焦文娟[17]的气质检测方法,略作修改。

样品前处理:称取0.1 g样品溶于3 mL正己烷中,加入3 mL KOH溶液(0.4 mol/L甲醇),50 ℃振荡孵育15 min。5 000 r/min离心5 min分层,移取上层有机相,经无水Na2SO4除水,过0.22 μm有机滤膜后转移至带有200 μL内插管的进样瓶中,后续进行GC-MS测定,采用归一化法进行定量。

气相色谱条件:采用HP-INNOWax毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm),进样量0.1 μL,分流比60∶1,进样温度250 ℃;溶剂延迟3 min;载气为He,1.2 mL/min;升温程序为初始温度130 ℃,保持1 min后以5 ℃/min增加到250 ℃,最后以250 ℃保持3 min。

质谱条件:EI;电离能70 eV;离子源温度230 ℃;检测模式为全扫描模式。

1.3.4 共轭二烯和共轭三烯的测定

参考GB/T 22500—2008《动植物油脂 紫外吸光度的测定》方法,测定232和268 nm下的紫外吸光度。

1.3.5 茴香胺值的测定

参考GB/T 24304—2009《动植物油脂 茴香胺值的测定》方法。

1.3.6 数据统计分析

所有试验与指标测定均平行3次,使用Excel 2019、SPSS 25.0等软件进行数据统计分析,用Duncan法进行多重比较(P<0.05),利用Origin 2022b绘制图形。

2 结果与分析

2.1 不同加工条件下单氯丙醇酯和缩水甘油酯的变化规律

考察了加热时间、加热温度以及油水比对烘焙模拟体系中的MCPD酯和GEs生成的影响规律。如图1所示,初始体系GEs含量最高[(0.589 9±0.005 3) mg/kg],其次为3-MCPD酯[(0.485 4±0.010 5) mg/kg]、2-MCPD酯[(0.234 0±0.009 8) mg/kg],这些危害物是油脂在精炼过程中产生的,并可进入食品加工体系。

a-3-MCPD酯的含量;b-2-MCPD酯的含量;c-GEs的含量图1 不同加热温度下烘焙模拟体系中MCPD酯和GEs的变化Fig.1 Changes in the content of MCPD esters and GEs in baking models at different temperatures注:小写字母代表不同加热时间的样品在同一温度条件下的显著性差异(P<0.05)。

加热时间是影响MCPD酯和GEs生成的主要因素之一。随着加热时间的延长,烘焙模拟体系中的MCPD酯和GEs含量总体均呈现先上升后下降并逐渐保持稳定的趋势,说明在加热过程中同时进行着生成与降解反应,与张渊博等[18]的研究中先上升后下降的趋势相似。图1-a中可见,3种温度下,加热5 min时产生的3-MCPD酯含量最高;当加热时间增加至15 min,180和200 ℃下模拟体系中的3-MCPD酯含量分别为(0.465 9±0.015 8)和(0.457 9±0.004 5) mg/kg,已低于初始含量(0.485 4±0.010 5) mg/kg,此时3-MCPD酯的总生成量已经小于总降解量。图1-b中,2-MCPD酯变化规律与3-MCPD酯基本一致,说明模拟体系加热过程中3-MCPD酯降解的主要原因不是异构化成2-MCPD酯,可能是脱酰化等其他的降解途径。又如图1-c所示,GEs的变化规律与MCPD酯略有差异,所有温度条件下模拟体系在加热10 min时产生最多的GEs。

除了加热时间,加热温度也是MCPD酯和GEs的重要影响因素之一[19-20],并与时间存在交互作用。当加热较短时间(0～10 min),3-MCPD酯含量随着温度的升高而增加,在200 ℃加热5 min时产生了最高含量的3-MCPD酯[(0.647 7±0.006 6) mg/kg];而GEs含量随着温度升高而减少。当加热在20～30 min间,不同温度条件下MCPD酯含量和GEs都具有显著性差异(P<0.05),此时2-MCPD酯、3-MCPD酯和GEs都随温度升高而降低,表明MCPD酯和GEs热稳定性都不高[14,19]。GEs含量与温度始终呈负相关,原因可能是GEs存在亲电子的环氧结构,在水分含量较高的模拟体系中易受到亲核物质的攻击而开环[18],从而稳定性较差。而MCPD酯在加热时间分别为5和30 min时与温度呈现相反的相关性,可能与模拟体系中存在的蛋白有关。SADOWSKA-ROCIEK等[16]曾发现蛋白含量与3-MCPD酯含量呈现正相关,但蛋白的作用仍尚不明确。在此推测,蛋白在烘焙模拟体系中起到了乳化作用,加热仅5 min时,蛋白的乳化能力未受到较大的破坏,使得前体物质甘油酯与氯离子的反应基本不受油水界面的限制,而高温提高了反应速率,促进了MCPD酯的生成;但当加热时间为30 min时,蛋白完全变性,油与水乳化状态被破坏,此时甘油酯与氯离子接触几率显著降低,MCPD酯生成较少,同时温度越高,热降解反应越强,因此MCPD酯含量越低。

此外,还探究了油水比对烘焙模拟体系中MCPD酯和GEs含量的影响。如图2所示,随着油水比的增大,3-MCPD酯的含量显著增加,即水分含量越低,3-MCPD酯越易生成。油水比为1∶6时3-MCPD酯的含量仅为(0.329 3±0.005 4) mg/kg,而油水比2∶5时含量已增加2倍多,达到(1.085 3±0.054 1) mg/kg,这可能是因为油是提供前体物质甘油酯的原料,低油水比体系不能提供足够的前体物质,限制了3-MCPD酯的生成速率,同时体系中高含水量使得降解反应更快。2-MCPD酯的含量同样也受油水比的影响(图2-b),呈现先增加后持平的趋势,在4∶3体系中产生了最高含量的2-MCPD酯[(0.263 3±0.013 9) mg/kg],然而当油水比大于3∶4后,其含量差异没有显著性(P<0.05)。而GEs含量基本保持稳定(图2-c),说明油水比不是GEs生成的主要影响因素。

a-3-MCPD酯的含量;b-2-MCPD酯的含量;c-GEs的含量图2 油水比对MCPD酯及GEs含量的影响Fig.2 Effects of oil-water ratio on the content of MCPD esters and GEs注:小写字母代表不同油水比样品的显著性差异(P<0.05)。

2.2 含不同油脂的烘焙模拟体系中单氯丙醇酯和缩水甘油酯的变化规律

不同油脂烘焙模拟体系中MCPD酯和GEs的含量变化规律如图3所示。在玉米油和椰子油体系中,3-MCPD酯的含量都随着加热时间的增加先上升后降低(图3-a),并在加热5 min时含量最高,分别为(0.647 7±0.006 6)和(0.386 4±0.008 3) mg/kg;而菜籽油体系中3-MCPD酯含量在加热15 min时才达到峰值[(0.718 1±0.004 7) mg/kg],比其他油脂烘焙体系产生了更多的3-MCPD酯,随后迅速下降;2-MCPD酯的含量变化规律与3-MCPD酯基本一致(图2-b)。菜籽油体系中MCPD酯特殊的变化规律可能是由于加热初期降解反应受到了较强的限制,随着加热的持续,限制因素失效后即刻迅速降解。不同油脂烘焙模拟体系中GEs的变化规律也存在差异,在玉米油和椰子油体系中仍保持先升后降的总体变化趋势,但菜籽油体系中GEs含量却随着加热时间的增加先降低后升高,表明GEs的生成反应在加热初期被抑制,初步猜测可能与菜籽油中高含量的不饱和脂肪酸有关。

2.3 脂肪酸组成的变化

当烘焙模拟体系中油脂种类不同,其脂肪酸组成也有明显差异。有研究基于量子化学模拟发现脂肪酸碳链长度和不饱和度会影响3-MCPD酯生成[21],因此脂肪酸组成可能对MCPD酯和GEs的生成有影响,为此测定了各油脂体系处理前后脂肪酸组成的变化(表2)。加热前,3种油脂中不饱和脂肪酸相对含量由高到低分别为菜籽油92.68%、玉米油84.52%、椰子油11.43%,其中油酸C16∶1是菜籽油的主要脂肪酸,亚油酸C16∶2是玉米油的主要脂肪酸,月桂酸C12∶0是椰子油的主要脂肪酸。而结合图3结果发现,3-MCPD酯和2-MCPD酯增长量在菜籽油体系中最大,在椰子油中最少,因此,不饱和脂肪酸相对含量较高的油脂可能更易生成MCPD酯。加热后,体系中饱和脂肪酸的相对含量都有所升高(P<0.05),单不饱和脂肪酸的相对含量都下降(P<0.05),是因为加热过程中不饱和脂肪酸发生了氧化,因此猜测3-MCPD酯和2-MCPD酯的生成可能与油脂的氧化存在一定关联。

表2 不同烘焙模拟体系中油脂脂肪酸组成的变化Table 2 Changes in fatty acid composition of oils in different baking models

2.4 油脂氧化程度的变化

为了分析油脂氧化与MCPD酯和GEs含量是否存在关联,同时也监测了样品加热过程中的氧化程度。由于高温处理的油中共轭二烯(conjugated dienes,CD)和茴香胺值与其总极性含量(total polar compounds,TPC)有良好的相关性[22],共轭三烯(conjugated trienes,CT)也能反映油脂的氧化程度,且CD、CT和茴香胺值的测定方法更简单、更快速,能分别反映油脂的初级氧化和次级氧化程度,因此采用测定CD、CT和茴香胺值来监测氧化程度,其中CD和CT通过测定油脂在232 nm(K232)、268 nm(K268)下的紫外吸收值来表征。

如图4所示,不同温度条件下,玉米油烘焙模拟体系中CD(图4-a)、CT(图4-b)含量都随着加热时间先增加后减少,茴香胺值(图4-c)随着时间增加而增加,并从15 min开始迅速攀升,说明大约在15 min时大量初级氧化产物开始加速氧化生成次级氧化产物。

a-232 nm下的紫外吸收值;b-268 nm下的紫外吸收值;c-茴香胺值图4 不同温度条件下油脂氧化程度的变化Fig.4 Changes in the degree of oil oxidation at different temperatures注:小写字母代表不同加热时间的样品在同一温度条件下的显著性差异(P<0.05)。

对玉米油不同油水比条件下的烘焙模拟体系(200 ℃加热30 min)的氧化程度测定结果如图5,油水比对CD和CT含量无影响,但对茴香胺值影响显著,油占比越大,茴香胺值越小,说明低水分环境能限制次级氧化产物的生成。

a-232 nm下的紫外吸收值;b-268 nm下的紫外吸收值;c-茴香胺值图5 油水比对油脂氧化的影响Fig.5 Effects of oil-water ratio on the oil oxidation注:小写字母代表不同油水比样品的显著性差异(P<0.05)。

含不同油脂的烘焙模拟体系中油脂氧化的变化如图6所示,随着加热时间的延长,CT和茴香胺值都不断增加,但CD的变化规律有所区别,如图6-a所示,椰子油的CD早在加热5 min时达到峰值(3.271±0.891),玉米油在加热10 min出现拐点(4.424±0.966),而菜籽油在30 min时CD仍在增加,达5.887±0.954,可见不饱和脂肪酸含量越高的油脂初级氧化持续的时间越长。

2.5 单氯丙醇酯和缩水甘油酯与油脂氧化的相关性分析

为了明确MCPD酯和GEs生成与油脂氧化之间的关系,以玉米油烘焙模拟体系为参考,对3-MCPD酯、2-MCPD酯、GEs含量与氧化指标做了Spearman相关性分析。结果如图7所示,3-MCPD酯与2-MCPD酯呈正相关(P<0.01),相关系数高达0.802,与CD值(K232)相关系数为-0.640,呈负相关(P<0.01);2-MCPD酯与CT值(K268)、茴香胺值均呈负相关(P<0.05);GEs与CD值呈正相关(P<0.01)。玉米油氧化程度越高,3-MCPD酯和2-MCPD酯含量反而越低,但初级氧化程度越高,GEs含量越高,可能是因为油脂在氧化的同时能限制MCPD酯的降解和GEs的生成,随着氧化程度增加,MCPD酯的降解反应和GEs的生成反应不再受限,导致MCPD酯和GEs含量分别减少和增加,与图3中菜籽油体系加热初期MCPD酯降解和GEs生成受限制的猜测相呼应,因此可以进一步推测,不饱和脂肪酸含量高的菜籽油更易氧化,对加热初期模拟体系中MCPD酯降解和GEs生成产生了更强的抑制效果。

图7 玉米油烘焙模拟体系MCPD酯和GEs与油脂氧化程度的相关性分析Fig.7 Correlation between the content of MCPD esters and GEs and the degree of oil oxidation in the baking models with maize oil

3 结论

通过对烘焙模拟体系加热过程的监测,发现MCPD酯和GEs都同时进行着生成与降解反应。加工条件是影响烘焙模拟体系中3-MCPD酯、2-MCPD酯和GEs含量的重要因素,其中温度和时间能显著影响这3种物质的含量,且存在交互作用,油水比也是MCPD酯生成的影响因素,但不影响GEs的生成。此外,油脂种类对MCPD酯和GEs的生成具有重要作用,并可能受其脂肪酸组成的影响,其中不饱和脂肪酸含量为92.68%的菜籽油能产生更高含量的MCPD酯和较低含量的GEs,而玉米油烘焙模拟体系中油脂氧化程度与MCPD酯和GEs之间存在显著的相关性,由此推测富含不饱和脂肪酸的油脂能通过自身氧化抑制MCPD酯的降解和GEs的生成。本研究结果为控制烘焙食品中MCPD酯和GEs提供了理论参考,另外,烘焙体系中蛋白的存在是否会影响MCPD酯和GEs的生成以及油脂氧化涉及影响MCPD酯和GEs降解或生成的具体机理还有待进一步探索。