岳盼盼，张为民，杨 东，张亚男，郑 鹏，闫 雪*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117）

核转录E2相关因子2（Nrf2）/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）/血红素氧合酶（HO-1）信号通路在调节氧化应激反应中发挥着极为重要的作用，可通过调节下游因子的表达，提高机体抗氧化能力保护细胞组织[1]。中医针刺疗法在治疗高脂血症方面具有独特优势，对脂质代谢具有双向调节作用[2]，而针刺疗法治疗高脂血症是否通过影响氧化应激水平而发挥疗效未有明确研究证实，故本实验拟通过Nrf2信号通路，探讨其作用机制，为针刺疗法治疗高脂血症提供实验室依据，并为临床治疗高脂血症提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康SPF级Wistar大鼠32只，雄性，体质量170～200 g，购自中国长春亿斯实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（吉）-2018-0007，动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0014。所有动物均进行适应性饲养7 d，自由获得食水，饲养环境温度（24±2）℃，相对湿度为55%±2%，12 h光照/12 h黑暗周期。

1.1.2 仪器与试剂 阿托伐他汀钙片（立普妥，国药准字：H20051408，规格：每片20 mg）购自辉瑞制药有限公司；一次性针灸用具（规格：0.25 mm×40 mm；生产批号：200302）购自贵州安迪药械有限公司；高脂饲料（基础饲料47%、蔗糖10%、蛋黄粉20%、猪油20 g、胆固醇2%、脱氧胆酸钠1%），饲喂用玉米芯垫料购自中国长春亿思实验动物科技有限公司；总胆固醇（TC，批号：20210926EX）、三酰甘油（TG，批号：20210926EQ）、低密度脂蛋白（LDL，批号：20210926EE）、高密度脂蛋白（HDL，批号：20210926ET）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：20210926EN）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST，批号：20210926EF）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：20210926EX）、过氧化氢酶（CAT，批号：20210926EC）、丙二醛（MDA，批号：20210926EC）测定试剂盒均购自上海晶美生物技术有限公司；Nrf2抗体（BS1074R）、HO-1抗体（Bioss，BS23667R）购自北京博奥森生物技术有限公司、Keap1抗体（Solarbio，K001511P）购自北京索莱宝科技有限公司。病理石蜡切片机（biocut）、石蜡切片展片机（HI1210）、生理组织包埋机（arcadia H，arcadia C）均购自德国Leica公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组与干预 将32只Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、药物组和针刺组，各8只。空白组饲喂普通饲料，饮用蒸馏水；其他3组根据高脂饮食饲喂的方法构建高脂血症模型，采用高脂饲料（基础饲料47%、蔗糖10%、蛋黄粉20%、猪油20 g、胆固醇2%、脱氧胆酸钠1%）、15%（M/V）果糖溶液共同饲喂，自由饮食、饮水，不限活动，4周末检测大鼠的血脂水平，与空白组相比，模型组大鼠出现TC、TG、LDL水平升高，HDL水平降低，表明高脂血症大鼠模型建立成功。造模成功后药物组给予阿托伐他汀钙片2.5 mg·kg-1灌胃，每日1次；针刺组固定于自制的大鼠固定器上，针刺双侧曲池（4 mm）、足三里（2 mm），采用单手进针法，用0.25 mm×40 mm针具，每次30 min，每日1次，每周5次，连续治疗4周。治疗期间空白组与模型组仅进行固定，未行针刺。

1.2.2 标准制备 末次治疗后，所有大鼠禁食不禁水24 h，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏取血，血液样品37 ℃恒温箱孵育1 h后，4 ℃恒温放置3 h，随后5 000 r·min-1离心10 min，采集血清。随后脱颈处死大鼠，解剖摘取肝脏，去除脏器周围结缔组织与脏器表面血，将肝脏一分为二，其中一份立即放置液氮中速冻后置于-80 ℃用于蛋白免疫印迹实验（Western blot），另一份于10%多聚甲醛中固定用于苏木精-伊红（HE）染色。

1.2.3 生化分析 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清TC、TG、LDL、HDL、ALT、AST、SOD、CAT、MDA水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 肝脏组织病理学观察 肝组织固定，石蜡包埋，病理切片机取8 μm厚的切片，行常规HE染色。

1.2.5 Western blot检测Nrf2/Keap1/HO-1信号通路相关蛋白表达 使用RIPA试剂盒制备总蛋白提取物，组织匀浆用12 000 r·min-1，4 ℃，离心4 min，取上清液为总蛋白溶液，使用BCA试剂盒测定蛋白质含量并调整到均匀浓度。蛋白质样品与10.0%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上90 min。NC膜经用3% BSA封闭液中封膜1 h后，与特异性一抗Nrf2（1:1 000）、Keap1（1:500）、HO-1（1:1 000）在4 ℃环境下孵育12 h，用含0.05%Tween-20的Tris盐酸缓冲液（TBST）清洗NC膜，然后用1:3 000稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG二抗在37 ℃中孵育1 h。使用Image Quant LAS 4000（Fuji Film，Tokyo，Japan）对条带进行量化，以GAPDH为内参。

1.3 统计学方法

数据使用SPSS 23.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清TC、TG、LDL、HDL水平比较

见表1。

表1 各组血清中TC、TG、LDL、HDL水平的比较（±s，n = 8） mmol·L-1

表1 各组血清中TC、TG、LDL、HDL水平的比较（±s，n = 8） mmol·L-1

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与药物组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别TCTGLDLHDL空白组1.60±0.080.65±0.080.73±0.141.01±0.11模型组2.75±0.11##1.24±0.14##1.52±0.09##0.59±0.07##药物组2.14±0.04△△0.71±0.04△△0.98±0.09△△0.81±0.06△△针刺组2.38±0.05△△▲▲1.02±0.07△△▲▲1.22±0.07△△▲▲0.72±0.05△△▲

2.2 各组血清中ALT、AST水平比较

见表2。

表2 各组血清中ALT、AST水平比较（±s，n = 8） U·L-1

表2 各组血清中ALT、AST水平比较（±s，n = 8） U·L-1

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与药物组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别ALTAST空白组37.53±2.5830.59±2.37模型组56.81±2.71##48.61±3.05##药物组47.78±1.00△△37.27±1.98△△针刺组50.08±1.26△△▲43.79±3.15△△▲▲

2.3 各组血清中SOD、MDA、CAT的水平比较

见表3。

表3 各组血清中SOD、MDA、CAT的水平比较（±s，n= 8）

表3 各组血清中SOD、MDA、CAT的水平比较（±s，n= 8）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与药物组比较，▲▲P＜0.01

组别SOD/（ U·L-1）MDA/（mmol·L-1）CAT/（ U·L-1）空白组210.56±9.76 5.98±0.39301.16±10.18模型组129.90±12.02##12.04±1.15##234.76±9.61##药物组177.33±7.72△△ 6.45±0.68△△285.65±3.77△△针刺组152.18±11.05△△▲▲10.24±1.02△△▲▲268.34±7.30△△▲▲

2.4 各组肝脏组织病理变化

空白组肝脏细胞形态正常，肝脏组织细胞质丰富，大小均匀，以中央静脉为中心向周围放射状排列。模型组肝细胞排列略紊乱，出现轻度脂肪病变。与模型组比较，针刺组及药物组肝脏组织脂肪性病变程度较低。见图1。

2.5 各组Nrf2、HO-1、Keap1蛋白表达水平比较

见表4。

表4 各组肝脏组织Nrf2、HO-1、Keap1蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究选用的足三里为足阳明胃经腧穴，是本经合穴，也是胃之下合穴，经相关研究[5]表明降脂效果确切且能够影响脂质代谢通路的信号传导；曲池为手阳明大肠经合穴，可通腑泄浊，利湿清热，起到化痰降浊、运脾通腑的作用，可有效降低三酰甘油、总胆固醇及低密度脂蛋白的水平[6]；且阳明为多气多血之经，配以两经合穴，以行气活血，除湿化痰通络。本研究结果中发现针刺大鼠可以使血清TC、TG、LDL水平下降，HDL水平上升，表明针刺疗法能够使高脂血症大鼠脂质水平得以下降；模型组ALT、AST水平升高，针刺组ALT、AST水平降低。进一步病理学观察发现，脂肪性病变出现于模型组肝脏，相对而言，针刺组肝脏脂肪性病变程度较低，说明针刺疗法能够改善肝脏细胞变性程度，同时还可以保护高脂血症模型的肝脏功能。

Nrf2/Keap1/HO-1信号通路是调节机体氧化-抗氧化轴的重要途径。长期高脂血症状态下，肝脏出现脂肪变性等病理性改变，并伴随着Nrf2蛋白的表达上升[7]。在此信号通路中，Nrf2作为抗氧化应激反应的关键因子，当机体处于氧化应激状态时，Nrf2与Keap1分离，游离的Nrf2易位到细胞核，进一步激活HO-1等下游基因的表达[8]。本实验中模型组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白的表达高于空白组，Keap1蛋白表达低于空白组，可能是由于肝脏脂质代谢出现紊乱，机体出现氧化应激，Nrf2/Keap1/HO-1信号通路启动抗氧化应激程序以减低损伤，进而保护肝脏细胞；针刺组和药物组Nrf2、HO-1蛋白的表达高于模型组，Keap1蛋白表达低于模型组，结合前期MDA含量下降，SOD、CAT水平上升，提示针刺疗法可改善高脂血症大鼠肝脏功能，其提高机体抗氧化能力与Nrf2/Keap1/HO-1信号通路抑制氧化应激反应有关。