周巧，刘健，忻凌，郭锦晨，黄旦，齐亚军，4，胡月迪，4

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学第二附属医院 安徽合肥 230061

3 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

4 安徽省中医药科学院风湿病研究所 安徽合肥 230031

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis， RA）特点是滑膜慢性炎症[1]。骨关节炎（Osteoarthritis，OA）的特征是关节组织发生病变[2]。RA 影响全球人口的0.5%～1%[3]，而有超过5 亿人（约占全球人口的7%）患有OA[4]。许多治疗药物（如非甾体抗炎药、糖皮质激素和免疫抑制剂）有各种不良反应，中医药可以作为RA 和OA 的补充和替代药物[5]。

中医学认为，RA 和OA 都属于“痹证”范畴，本团队在新安医学“固本培元、扶正祛邪”治痹思想指导下，提出“脾虚致痹”“从脾治痹”学术观点，创制新安健脾通痹方新风胶囊（Xinfeng capsule，XFC）[6]。XFC可以改善RA 患者关节症状体征、疾病活动性指标和焦虑抑郁，提高生活质量[7]。且XFC 治疗 OA 安全有效，在改善 WOMAC 指数总分、疼痛等方面优于氨基葡萄糖组[8]。目前对于XFC 治疗RA 与OA 的共同机制的研究相对不足。网络药理学是在已有数据库的基础上，将网络生物学和多分子药理学相结合，为探索中药方剂治疗疾病的机制和协同作用提供了一种新的途径[9]。

本研究运用网络药理学以及分子对接，探索XFC治疗RA 与OA 的共同机制，为中医“异病同治”的深入研究提供依据。

资料和方法

1 XFC 化学成分筛选

由TCMSP （https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）管理的计算机集成 ADME（吸收、分布、代谢和排泄）模型用于药物研究。应用口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）（OB ≥30）和药物相似性（Drug-likeness，DL）（DL ≥0.18）来识别生物活性化合物[10]。XFC主要中药成分黄芪、薏苡仁、蜈蚣和雷公藤。

2 疾病靶点及交集靶点获取

从TCMSP 数据库获得药物的靶标。利用UniProt数据库（http://www.uniprot.org/），限定物种是Homo sapiens，进行校正，收集XFC 活性成分靶点基因。以“Rheumatoid Arthritis” “Osteoarthritis”为关键词，检索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD 数据库，筛选条件为relevance score ≥10，收集与RA、OA 的靶点基因。对XFC 活性成分靶点与疾病靶点进行Venn 分析，筛选交集靶点。

3 拓扑网络分析

Cytoscape3.8.2 软件可视化XFC 治疗OA 和RA的药物- 成分- 靶点网络，该软件Analyze Network模块进行拓扑分析，计算度值（Degree）及介数中心性（Betweenness Centrality），并以节点度值大小为依据构建药物-化合物-靶点网络。

4 蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）网络拓扑分析及核心靶点筛选

将交集靶点基因导入STRING（https://string-db.org/），构 建PPI 网 络。Cytoscape 3.2.1 软 件 中Betweenness， Closeness， Degree， Eigenvector， LAC，Network 参数筛选核心靶基因[11]。

5 富集分析

应用R 3.6.0 软件进行GO 和KEGG 富集分析，确定XFC 治疗的生物学过程和信号通路。P值＜0.05和q值＜0.05 为有统计学意义。绘制XFC 治疗RA和OA 通路关系网络图。

6 分子对接

PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）获得靶点基因3D 结构。化合物的3D 构象异构体从PubChem数据库 （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取。Autodock Vina 软件来评估化合物-靶标关系的结合亲和力[12]。PyMol 软件可视化结合模型。

结 果

1 XFC 活性成分组成及成分筛选

搜索XFC 的中药成分，得到各药材的化学成分数量等信息，设定阈值后筛选的结果见表1。

表1 XFC 中各药材的化学成分数量

2 成分靶点收集筛选及疾病交集靶点

XFC 中活性化合物共有1180 个靶点。去重、校正和转化后，确定217 个的靶基因。不同数据库分别收集到RA 相关靶点基因2810、12、204、13、158 个。OA 相关靶点基因849、6、150、9、32 个。通过基因矫正、去重后获得204 个RA，849 个OA 相关靶基因。对XFC 活性成分和疾病靶点取交集，绘制Venn 图，获得111 个交集基因。见图1。

图1 A 图为OA 疾病交集靶点，B 图为RA 疾病交集靶点，C 图为OA 和RA 交集靶点Venn 图

3 构建“中药-化合物-潜在靶点”网络图

节点越多，代表靶基因相连的成分越多，见图2。蓝色正方形代表靶基因，红色椭圆形代表黄芪活性成分，绿色椭圆形代表雷公藤活性成分，黄色椭圆形代表薏苡仁活血成分，紫色椭圆形代表蜈蚣活性成分。分析表明，槲皮素、蜈蚣素、山柰酚、谷甾醇α1、芒柄花黄素、雷公藤甲素、豆甾醇、山海棠二萜内酯A 等11个化合物与≥30 个靶基因相关联。这些化合物和基因可能是网络中的关键节点。

图2 XFC-化合物-潜在靶点网络构建

4 PPI 网络拓扑分析及交叉靶点的筛选

构建交集靶点PPI 网络（A），使用Cytoscape 3.8.0软件模块分析，得到由96 个节点和422 个边组成的网络（B）。再用 CytoNCA 插件的拓扑参数分析，条件为Betweenness＞61.841，Closeness＞0.393，Degree＞7，Eigenvector＞0.0519，LAC＞3，Network＞4.159，得到24个节点和137 个边的网络（C），二次筛选以Betweenness＞293.012，Closeness＞0.459，Degree＞18，Eigenvector＞0.170，LAC＞7.525，Network＞10.211，构建有9 个节点和34 条边的靶点网络图（D）。其中节点代表目的基因，边代表连接节点的线，同一个节点多条线通过，说明越重要。节点大小、颜色深浅代表degree 值，边的粗细及透明度代表靶点间的关联性。拓扑分析出9 个核心靶点信息，分别为STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1。见图3。

5 富集分析

共揭示了2476 个GO 生物工程和175 条KEGG通路。GO 富集分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3 个分支。按照p 值升序排列，将BP、CC、MF 各前10 条GO 富集结果（图4A），纵坐标是GO 的名称，横坐标是基因的比例，圆圈的大小代表富集在每个GO 上基因的数目，圆圈颜色代表富集的显著性。生物过程中表明靶点主要涉及细胞对活性氧的反应（GO:0000302）、对细菌源性分子的反应（GO:0002237）、对氧化应激的反应（GO:0006979）。细胞组分主要涉及细胞膜（GO:0045121）、转录因子复合物（GO:0005667）等。分子功能涉及核受体活性（GO:0004879）、转录因子活性（GO:0098531）、细胞因子活性（GO:0005125）等。

KEGG 通路富集分析显示：纵坐标是通路的名称，横坐标是基因的数目，颜色代表富集的显著性，可知基因主要集中在类风湿关节炎（hsa05323）、IL-17 信号通路（hsa04657）、肿瘤坏死因子信号通路（hsa04668）、细胞凋亡（hsa04210）、NF-κB 信号通路（hsa04064）、破骨细胞分化（hsa04380）等，见图4B。桑葚图展示KEGG 通路途径基因表达情况（图4C），左侧代表每个通路中包含的基因，右侧为常规的气泡图，气泡大小表示通路所属的基因个数，气泡颜色表示p 值。这些与通路相关基因是XFC 治疗RA 和OA的关键靶点。干扰这些途径的某些靶点可能是XFC治疗RA 和OA 的潜在策略。

XFC 治疗RA 和OA 的主要通路及靶点涉及免疫炎症、血管生成因子、骨代谢、细胞凋亡通路等。选取KEGG 中与RA 及OA 相关的类风湿关节炎（图5A）和破骨细胞分化（图5B）通路绘制图形。红色标注代表XFC 参与疾病显著的基因。

图5 XFC 参与类风湿关节炎信号通路（A）和破骨细胞通路（B）

6 交集靶点与XFC 活性成分的分子对接验证

将XFC 活性成分与9 个交叉靶点进行分子对接，结合能＜0 提示配体与受体可自发结合，且结合构象稳定，所需结合能越低，≤-5.0kcal/mol 说明有较好结合活性，≤-7.0kcal/mol 说明有强的结合活性。本研究在对接结果中，大多数结合能＜-7.0kcal/mol。选取结合能＜-9.0kcal/mol 的对接结果进行可视化，展示小分子配体-蛋白质相互作用图，以及相互之间蛋白质、疏水相互作用、氢键、金属离子等关系（表2，图6）。分别是山海棠二萜内酯A（Hypodiolide A）与NR3C1结合能为-10.60 kcal/mol，槲皮素（Quercetin）与FOS为-9.70 kcal/mol，雷公藤甲素（Triptolide）与STAT3为-9.20 kcal/mol，谷甾醇α1（Sitosterol alpha1）与MAPK1 为-9.10 kcal/mol 和TNF 与蜈蚣素（Scolopendrine）为-9.0kcal/mol。以槲皮素为例，与FOS 形成ASN147（2.9 A，4.0 A），ASN271（3.4 A），ARG155（3.6 A，2.6 A），ARG279（3.1 A），ARG281（4.1 A）7 个氢键。2 个氢键相互作用被认为是强相互作用，距离分别为ASN147（4.0A）和ARG281（4.1A）。总体而言，我们发现氢键和静力是主要相互作用形式，相互作用形式的多样性决定其结合亲和力的能力。综合分析，山海棠二萜内酯A、槲皮素、雷公藤甲素、谷甾醇α1、蜈蚣素可能是XFC 治疗RA 和OA 的关键活性成分。

图6 XFC 活性成分和核心靶点的对接结果三维图（结合能≤-9.0kcal /mol），注：A-E 分别为NR3C1 与Hypodiolide A、FOS 与Quercetin、STAT3 与Triptolide、MAPK1 与Sitosterol alpha1、TNF 与Scolopendrine 的分子对接图

表2 核心靶点与其映射的XFC 活性成分的结合能

讨 论

“异病同治”是在辨证论治原则指导下产生的。类风湿关节炎、骨关节炎都属于中医学“痹证”的范畴。本团队提出“脾虚湿盛”“从脾治痹”的学术观点[6，13]。新风胶囊（XFC，由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成）应用于临床多年，疗效确切[7-8]。

本研究筛选产生了103 种XFC 活性化合物，217个靶点，Venn 分析获得111 个交集基因。槲皮素、蜈蚣素、山柰酚、谷甾醇α1、芒柄花黄素、雷公藤甲素、豆甾醇、山海棠二萜内酯A 等11 个化合物与≥30 个靶基因相关联。核心靶点分别为STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1。 这些化合物和基因可能是网络中的关键节点。山奈酚是黄芪、雷公藤的主要成分，可以抑制炎症细胞因子激活、TGF-β1 表达和氧化应激[14]。雷公藤甲素可以抑制细胞因子、粘附分子和趋化因子的分泌，可以调控JAK2/STAT3 信号通路，抑制RA 成纤维滑膜细胞炎症和细胞迁移[15]。雷公藤甲素可以通过介导circ0003353/miR-31-5p/CDK1 轴的表达来抑制RA 成纤维滑膜细胞的细胞生长和炎症反应[16]。槲皮素通过沉默调节蛋白1/单磷酸腺苷活化蛋白激酶（SIRT1/AMPK）信号通路抑制雌激素受体应激，抑制软骨细胞凋亡，逆转膝关节软骨退化[17]。β-谷甾醇抗炎机制可能是通过抑制表皮细胞和巨噬细胞炎症小体 NLRP3 的表达[18]。β-谷甾醇具有雌激素样作用，可能是调节骨代谢的重要的物质之一[19]。总的来说，这些活性成分从各个方面表现出抗风湿作用，包括抗炎、免疫调节、减少骨侵蚀和破坏以及减轻氧化损伤。证实了XFC 治疗 RA 和OA 中成分的集体有效性和多样性。

KEGG 通路富集分析表明，某些类型的病毒感染和癌症也可能在网络中至关重要。病毒感染与RA 密切相关（如Epstein-Barr 病毒感染），并且 RA 患者患癌风险增加[20]。类风湿关节炎、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll 样受体信号通路、Th17 细胞分化、NF-κB 信号通路、破骨细胞分化等可能是关键信号通路。IL-17 信号通路和TNF 信号通路被认为是经典的免疫信号通路，可以激活RA[21]、OA[22]发病的细胞内分子信号。KOA 的发病机制可能与 IL-17A （rs2275913）基因呈正相关[23]。Toll 样受体参与免疫起始环节，可通过识别病原相关分子模式激活相关信号通路，导致RA 和OA 的发生[24-25]。NF-κB 是炎症反应、自身免疫和细胞增殖、凋亡中的重要转录因子[26]。

在可视化的通路-靶点网络中（图4C），RELA、MAKT1、MAPK14、JUN、IKBKB、FOS、MAPK8、NFKBIA、IKBKB、AKT 等参与了许多通路，表明XFC 可能多通路和多靶点联合相互作用发挥作用。通路图直观显示XFC 治疗类风湿关节炎和破骨细胞分化通路的代谢途径。图5A 中所示，RA 的发病机制可能涉及多种免疫和炎症细胞，如树突细胞（DC）、T 细胞、巨噬细胞和效应细胞，包括软骨细胞、破骨细胞、FLS 和血管细胞。T 细胞受体信号通路参与了自身反应性Th1 细胞从DC 分化。Th17 细胞的分化和IL-17 的分泌被认为是T 细胞介导的炎症反应的早期激活因子。这三个途径代表了RA 发生的早期启动子。JAKSTAT、PI3K-AKT 和MAPK 信号通路参与破骨细胞分化，导致骨和关节破坏。FLS 可通过TNF 信号通路和Toll 样受体信号通路激活，从而促进炎症。此外，VEGF 信号通路可能参与白细胞迁移和炎性细胞浸润。图5B 可见，破骨细胞通路涉及破骨细胞、巨噬细胞和Th1 细胞，涉及的信号通路有JAK-STAT、PI3KAKT、MAPK、NF-κB。红色标注代表XFC 参与疾病显著的基因。

分子对接分析研究候选化合物和靶标的相互作用。对结合能小于-9.0kcal/mol 的进行可视化，分别是山海棠二萜内酯A 与NR3C1，槲皮素与FOS，雷公藤甲素与STAT3，谷甾醇α1 与MAPK1 和TNF 与蜈蚣素。表明XFC 是通过调节相关靶点来发挥作用的。

本研究结果表明，新风胶囊通过调节多种途径发挥其在OA 和RA 中的药理作用，包括细胞周期、细胞凋亡、炎症和免疫调节等。活性成分（如槲皮素、山海棠二萜内酯A、雷公藤甲素、谷甾醇α1 和蜈蚣素）可能是通过调节STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1 目标基因，以及调节JAKSTAT、PI3K-AKT、MAPK、NF-κB 信号通路发挥抗炎抗免疫作用，达到治疗疾病的目的。然而，本研究也有一定的局限性，由于各平台数据库及相应的分析算法和软件功能的限制，另外这些结果需要实验研究。