杨晓娜 陈宏艳 陈自宏

（保山学院资源与环境学院，云南保山 678000）

树莓（RubusidaeusL.）又称为覆盆子、悬钩子等，是蔷薇科悬钩子属植物，灌木性果树，其果实具有丰富的营养价值和保健功能，深受消费者喜爱[1]。树莓含有丰富的营养成分及功能活性物质，例如花色苷、黄酮等，红树莓除了鲜食外，还被加工成冷冻果、果酱、果汁、果酒等[2]。花色苷是一种天然色素，具有抗菌、降低血压、强化免疫系统的功能等作用[3]，它也是一种天然的抗氧化剂，能够很好地清除生物体内常见的活性氧，普遍认为花色苷的抗氧化性决定其生物活性和保健作用[2]。经查阅文献，红树莓花色苷的提取方法主要集中在有机溶剂法[2，4]和超声波提取法[5-13]。与常规的花色苷提取方法相比，双水相提取易操作，可连续、可扩大生产且绿色环保[14]，因而在天然活性成分的提取中得到广泛应用[15-16]。本研究采用超声辅助双水相提取红树莓花色苷，经响应面优化，在最佳工艺条件下提取红树莓花色苷，并研究其抗氧化活性，有利于提升红树莓的附加值，提高花色苷的含量，为红树莓作为抗氧化功能性产品提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓产自云南嵩明，其品种为西班牙Adilita，鲜果当天采摘后空运，分装后置于-20℃下冷冻保存；无水乙醇、硫酸铵、无水乙酸钠、氢氧化钠、盐酸、氯化钾等分析纯：津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（CP114）：奥豪斯仪器有限公司；九阳料理机（JYL-C012）：杭州市九阳有限公司、智能静音超声波清洗机（XM-800UVF）：小美超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-5500PC）：上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红树莓花色苷最大吸收波长

冷冻红树莓先解冻，用料理机打成匀浆，备用。用烧杯称取红树莓匀浆2 g，40%乙醇体积分数、1∶20 料液比、800 W 超声功率、0.4 g/mL 硫酸铵浓度、50℃、提取50 min，将静置分层后取上相液进行可见光区光谱扫描[17]，确定红树莓花色苷最大吸收波长。

1.3.2 红树莓花色苷含量测定方法

缓冲溶液的制备方法参看文献[18]。用pH示差法[18]测定花色苷含量。

根据下式计算溶液中花色苷的含量（mg/g）：

ɛ 代表摩尔吸光系数，ɛ=26 900；L 代表比色皿的厚度（cm）；M 代表矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔质量，M=449.2 mg/mol；DF代表稀释的倍数；V代表定容体积（mL）；W代表红树莓样品质量（g）

1.3.3 单因素试验方法

乙醇体积分数17.5%～27.5%，硫酸铵浓度0.45～0.65 g/mL，超声功率400～720 W，时间为10～50 min，料液比1∶10～1∶50，进行花色苷提取。研究乙醇体积分数、硫酸铵浓度浓度、超声功率、液料比、时间，对红树莓花色苷含量的影响。

1.3.4 响应面中心组合试验设计

根据单因素数据，选取四个因素变量，以红树莓花色苷含量为响应值，用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken优化超声波辅助双水相提取红树莓花色苷的工艺。

1.3.5 DPPH清除自由基能力测定方法

DPPH清除自由基能力测定方法，参看参考文献[2]，各溶液添加量见表1。

表1 DPPH 清除自由基能力测定方法中各溶液的添加量

式中，A1表示DPPH 溶液+花色苷提取液的吸光值；A2表示无水乙醇+花色苷提取液的吸光值；A0表示无水乙醇+DPPH溶液的吸光值[18]。

1.3.6 羟自由基清除率测定方法

羟自由基清除率测定方法，参看文献[19]，各溶液添加量见表2。

表2 羟基自由基清除能力测定方法中各溶液的添加量

式中，A0表示不加花色苷溶液的空白对照吸光度值；A1表示加花色苷溶液的吸光度值；A2表示无显色剂时的吸光度值[18]。

1.3.7 数据统计及分析

实验数据用Origin软件统计，SPSS（20.0）进行ANOVA邓肯差异分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 红树莓花色苷可见光光谱特征

蒸馏水作空白对照，测定红树莓花色苷提取液的吸收光谱，花色苷的最大吸收峰通常在270～280 nm 和510～540 nm 的范围内[2]，红树莓花色苷的紫外光谱为图1。如图1 所示，红树莓花色苷最大吸收峰在532 nm处。

图1 红树莓花色苷最大吸收峰

2.2 乙醇体积分数对花色苷含量的影响

如图2所示，花色苷含量呈现随乙醇体积分数的增大而增高，在乙醇体积分数为22.5%，花色苷的含量达到最大时，为0.218 mg/g。当乙醇体积分数超过22.5%时，含量开始下降。这可能是因为花色苷属于极性较强的物质，乙醇的体积分数增大会引起溶液极性变弱，提取效果变差[15]。虽然乙醇体积分数为22.5%与20%和25%相比，没有显著性差异，但是考虑到含量和耗能，于是选取了22.5%为花色苷提取的最佳乙醇体积分数。

图2 乙醇体积分数对红树莓花色苷含量的影响

2.3 硫酸铵浓度对花色苷含量的影响

如图3 所示，随着硫酸铵浓度升高，红树莓花色苷含量是逐渐增大的。当硫酸铵浓度达到0.55 g/mL 时，花色苷的含量最高，为0.149 mg/g，硫酸铵浓度超过0.55 g/mL 时，其含量开始下降，硫酸铵浓度从0.55 g/mL 到0.60 g/mL 时，含量下降明显。这是由于花色苷溶于乙醇，当增加硫酸铵的浓度时，其与乙醇竞争水，乙醇减少，花色苷的量也随之减少[16]。

图3 硫酸铵浓度对红树莓花色苷含量的影响

虽然硫酸铵浓度0.5 g/mL 与0.45 g/mL 和0.55 g/mL 相比，没有显著性差异，但出于含量和耗能的原因，选取的最佳硫酸铵浓度是0.55 g/mL。

2.4 超声功率对花色苷含量影响

如图4 所示，随着超声功率增大，红树莓花色苷含量也在逐渐增大。超声功率为560 W 时，花色苷的含量达到最大，为0.088 mg/g。超声功率超过560 W 时，其含量开始下降，超声功率从560 W 到640 W 时，花色苷含量下降较快，这是由于超声波的机械效应促使花色苷成分发生降解，使花色苷含量下降[14]。虽然超声功率设置的梯度之间并没有显著性差异，但结合含量和耗能考虑，选取了560 W为最佳超声功率。

图4 超声功率对红树莓花色苷含量的影响

2.5 超声时间对花色苷含量的影响

如图5所示，红树莓花色苷含量呈现随超声时间增加，较缓慢地增大后下降的趋势。当超声时间为30 min时，花色苷的含量最高，为0.130 mg/g。超过30 min时，红树莓花色苷含量又开始下降。这是因为超声时间增加能促进细胞壁破裂，使花色苷浸出速率和程度提高，但时间过长的话会使花色苷成分被破坏，致使含量有所下降[14]。虽然超声时间为30 min 时与20 min 和40 min 相比而言，并没有显著性差异，但出于对花色苷含量和耗能考虑，选取30 min为最佳超声时间。

图5 时间对红树莓花色苷含量的影响

2.6 料液比对花色苷含量的影响

如图6 所示，随着料液比增大，红树莓花色苷含量呈增大趋势。在料液比是1∶20 时，花色苷的含量达到最大，得到0.238 mg/g。料液比＞1∶20 时，花色苷含量又开始下降，料液比从1∶20 到1∶25 时，花色苷含量下降较快。原因是随着提取液增多，样品与提取液接触更加地充分，提取量上升，但提取液继续增多的话，花色苷的溶出量达到了饱和，提取量就呈下降的趋势[15]。1∶20 的料液比与其他梯度相比，差异显著，且含量最高，故选取的最佳料液比为1∶20。

图6 料液比对红树莓花色苷含量的影响

2.7 响应面优化结果与分析

2.7.1 因素水平的选取

根据单因素结果，进行4因素3水平的试验设计，见表3。

表3 实验因素与水平设计

2.7.2 响应面分析

乙醇体积分数、硫酸铵浓度、超声功率、料液比作为自变量，响应值为花色苷含量，进行Box-Beheken响应面试验设计，结果见表4。

表4 响应面实验设计及结果

经过回归拟合，得到如下的回归方程：

Y=0.17-8.900E-003A-7.708E-003B-0.014C+0.016D+0.020AB-0.023AC-9.375E-003AD-5.000E-003BC+0.017BD-0.021CD-5.875E-004A2-0.031B2+0.019C2-0.036D2

由表5 可知，模型的P 值＜0.000 1，表明拟合程度良好，模型极显著。模型的相关系数为R2=0.929 9，红树莓花色苷含量与各个因素之间的线性关系显著，失拟项P值为0.080 4（＞0.05），说明这个模型是可以用来分析和预测红树莓理论上的花色苷含量。B、AD、A2对模型影响不显著，A、BC 影响显著，C、D、AB、AC、CD、B2、C2、D2影响极显著。均方值的大小表示因素影响的强弱，均方值越大就说明因素对花色苷含量的影响越大[7]。表4可知，四个因素对红树莓花色苷含量影响大小为：料液比（D）＞超声功率（C）＞乙醇体积分数（A）＞硫酸铵浓度（B）。因此，超声辅助双水相提取花色苷的最佳工艺为：25%的乙醇体积分数、0.55 g/mL 的硫酸铵浓度、640 W 超声功率、超声30 min、1∶20的料液比，花色苷的含量为0.219mg/g。

通过Design-Expert 软件，得到了各个因素之间相互作用的响应面图，见图7。3D 响应面图倾斜度都反映了各因素之间的相互关系，倾斜度越高，坡度越陡，就说明两因素交互作用越显著[7]。图7（a）显示，乙醇体积分数与硫酸铵浓度二者交互作用对花色苷含量的影响显著。图7（b）显示，乙醇体积分数与超声功率二者交互作用对花色苷含量的影响显著。图7（c）显示，曲面是相对平缓的，乙醇体积分数与料液比二者交互作用对花色苷含量的影响不显著。图7（d）显示，硫酸铵浓度与超声功率二者交互作用显著。图7（e）显示，曲面是相对平缓的，硫酸铵浓度与料液比二者交互作用对花色苷含量的影响不显著。图7（f）显示，超声功率与料液比交互作用对花色苷含量影响显著。

2.7.3 树莓花色苷对DPPH自由基的清除率

由图8可知，随着浓度的增大，花色苷和维生素C对DPPH清除率不断增强，花色苷浓度较低时，清除率也是高于维生素C 的。当溶液浓度达到4.8 mg/L 时，其清除率分别为94.93%和31.31%，相同浓度的红树莓花色苷溶液对DPPH 的清除能力比维生素C 的高。说明红树莓花色苷对DPPH 的清除能力较强，主要原因是由于花色苷为粗提物，成分复杂多样，因此花色苷抗氧化的效果优于维生素C。

图8 DPPH自由基清除能力

2.7.4 树莓花色苷对羟基自由基的清除能力

由图9 可知，随着红树莓花色苷和维生素C 浓度的增大，花色苷和维生素C 对羟自由基的清除率不断增强，花色苷在低浓度时，清除率比维生素C 高。当溶液浓度达到5.5 mg/L 时，其清除率分别为45.83%和22.15%，相同浓度的红树莓花色苷溶液对羟自由基的清除能力是高于维生素C 的。说明红树莓花色苷具有较强的对羟自由基的清除能力，主要原因可能是由于花色苷为粗提物，成分复杂多样，因此花色苷抗氧化的效果优于维生素C。

图9 羟基自由基清除能力

3 讨论

试验结果表明，采用超声波辅助双水相法提取红树莓花色苷，含量为0.219 mg/g。杨蕙菱[2]采用溶剂法对红树莓花色苷进行提取，实际得到的花色苷含量为0.274 5 mg/g，优于河南信阳红树莓的（0.162 mg/g）。单一用超声波辅助法，红树莓花色苷含量为0.163 mg/g[16]。

相比超声提取，超声辅助双水相系统的提取量更高且节约耗能。下一步将以多种方法辅助双水相来研究红树莓花色苷的提取工艺，进一步提高其含量。红树莓花色苷对DPPH 和羟基自由基的清除能力随着浓度的增大而增大，用相同浓度的维生素C溶液作对照，红树莓花色苷的清除率是高于维生素C。综上，超声辅助双水相提取红树莓花色苷的提取效果较佳，且红树莓花色苷有较好的抗氧化性能力，具有开发潜力。本试验为红树莓的深加工提供了一种新途径。