王彦钦，孟宪刚，李武阳，罗光宏

（1.兰州交通大学生物与制药工程学院，甘肃 兰州 730070；2.河西学院甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000）

盐胁迫是植物生长发育过程中经常遭遇的主要非生物胁迫之一。当植物遭遇盐胁迫，自身会启动保护机制，闭合气孔以减少水分散失，而气孔的闭合会导致叶片CO2浓度（Ci）下降，从而抑制暗反应[1]。同时，高浓度的离子还会造成光类囊体解离，使叶绿体结构遭到严重破坏，进而导致光反应受到抑制[2]。因此，盐胁迫会使作物光合效率降低，从而抑制其生长，最终导致产量降低[3]。此外，在盐胁迫下，高等植物的水分运输和抗氧化系统也会受到一定干扰，进而导致其产量和品质降低[4]。据报道，我国耕地盐渍化面积占总耕地面积的6.62%，达到了920.9 万hm2[5]。加强盐碱化土壤的综合开发与运用，将对我国粮食安全起到重要作用[6]。

微藻是一类光合利用度高的低等自养生物，其分布广泛，种类繁多，具有固碳、固氮等特性[7]。研究发现，微藻可以促进植物生长，提升植物抗逆性[8-11]。BABU 等[8]研究发现，与不接种固氮蓝藻的对照相比，接种固氮蓝藻处理小麦在处理后14 d 鲜质量增加30%～60%，干质量增加14%～40%。钟国民等[9]研究发现，应用藻类活性细胞生物肥能促进水稻分蘖，提高成穗率、有效穗数、结实率和实粒数，进而提高水稻产量。XU 等[10]研究发现，纤细席藻产生的多糖可以提高植株的K+、Ca2+、Mg2+含量及光合活性；增强超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低活性氧含量，减少氧化损伤；还可以促进柠条、锦鸡儿的种子萌发和幼苗新陈代谢。杜氏盐藻和其β-胡萝卜素提取物可以提升中度盐胁迫下南瓜总生物量、产量、光合色素含量以及抗氧化物质含量等，进而提升南瓜抗中度盐胁迫的能力[11]。

衣藻是绿藻门衣藻科的单细胞藻类，其产生的孢子具有极强的耐受性，且藻株对环境无污染，对人畜没有致病性[12]。衣藻具有作为生物肥料的潜能，在盐胁迫环境下可以积累大量海藻糖，而海藻糖具有优良的渗透调节作用[13-14]。目前，衣藻在植物上的研究主要集中于提升土壤肥力[15]、促进植物生长[16]方面，在盐胁迫下植物上的应用研究鲜见报道，且衣藻对植物光合作用的影响尚不明确。为此，采用德巴衣藻（Chlamydomonas debaryana）藻粉作为试验材料，研究其对盐胁迫下小麦幼苗光合生理指标的影响，为衣藻粉在盐胁迫下小麦上的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为长丰2112，购自张掖当地农贸市场；衣藻藻粉由甘肃凯源微藻工程技术中心生产的微藻（德巴衣藻）干燥制成。

1.2 试验设计

采用20% 过氧化氢对小麦种子表面消毒15 min，然后用无菌水冲洗3 次，最后置于温度为25 ℃的培养箱内黑暗培养24 h。待种子发芽后，挑选萌发一致的种子放入清洗灭菌后的砂土盆中，并将其置于25 ℃、12 h 光照[300 μmol/（m2·s）]/12 h 黑暗的培养箱内进行培养。培养期间，向砂土盆内继续添加清水保持砂土湿润，用于催发小麦种子。待小麦长至两心一叶时，进行盐胁迫处理，共设6个处理，CK：每天施加50 mL 无菌水；T0—T4：连续5 d每天施加50 mL 150 mmol/L 的NaCl 溶液，从添加NaCl 溶液当日开始，T1—T4 处理分别每3 d 添加50 mL 0.25、0.5、1.0、2.0 g/L 的衣藻藻液，T0 处理同时添加50 mL 无菌水，共添加5 次。然后测定各生理指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 光合色素含量 处理后12 d，取0.1 g 小麦叶片，将其研磨捣碎后加入5 mL 80%丙酮溶液，低温超声处理20 min，于4 ℃放置24 h，离心后，取上清液，利用DR 600 紫外分光光度计分别在波长663、646、470 nm 处测定吸光值，以80%丙酮为空白对照。按下列公式计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的质量浓度。

式中，Ca、Cb和Cxc分别代表叶绿素a、b和类胡萝卜素的质量浓度。

1.3.2 光合气体交换参数 分别于处理后3、6、9、12 d，选取生长健壮、一致的小麦10 株，选取受光方向一致的旗叶，测定其净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和Ci，重复测量3次。

1.3.3 叶绿素荧光参数 分别于处理后3、6、9、12 d，选取生长健壮、一致的小麦10 株，在环境温度为25 ℃的情况下，于9：00 选取受光方向一致的旗叶，所选叶片暗适应30 min后，在距叶尖3 cm 处，利用Handy PEA 植物效率仪测定叶绿素荧光参数光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学效率（Fv/Fm），恢复光照后测定光化学淬灭系数（qP）、非光化学淬灭系数（qN）、PSⅡ实际光量子产量[（Y（Ⅱ）]和电子传递速率（ETR）。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2013 进行整理，用SPSS 21.0软件进行方差分析，用OriginPro 8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片光合色素含量的影响

由表1 可知，与CK 相比，T0 处理小麦幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量分别降低48.1%、25.0%、43.8%和43.4%。添加不同质量浓度的衣藻藻液后，除叶绿素b含量外，其他色素含量总体均较T0处理显著提高。添加衣藻藻液后，对于叶绿素a 含量，各处理均较T0 处理显著提高，表现为T4＞T3＞T2＞T1＞T0，仅T3和T4处理间差异不显著；对于叶绿素b 含量，总体上有所升高，但各处理间差异不显著；对于类胡萝卜素含量，各处理均显著提高，表现为T4＞T3＞T2＞T1＞T0，T4 处理最高，接近CK，较T0 处理提高71.1%；对于总叶绿素含量，各处理总体上均显著提高，表现为T4＞T3＞T2＞T1＞T0，仅T1处理与T0处理差异不显著。

表1 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片光合色素含量的影响Tab.1 Effect of concentration of Chlamydomonas debaryana on photosynthetic pigment content in wheat seedling leaves under salt stressng/g

2.2 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片光合气体交换参数的影响

2.2.1 Pn 如图1 所示，处理后3～12 d，T0—T4 处理小麦幼苗叶片Pn 均低于CK；随着处理后时间的推进，CK Pn 稍有降低，变化不明显，T0—T1 处理Pn逐渐降低，T2—T4 处理Pn 逐渐升高。在处理后3 d，T0—T4处理间Pn无明显差异；处理后6 d，T0—T4 处理间Pn 开始出现明显差异，表现为T3＞T4＞T3＞T1＞T0；处理后9 d，Pn 仍表现为T3＞T4＞T3＞T1＞T0，T3 处理较T0 处理提高37.5%，T2—T4 处理较处理后6 d 提高，与CK 间的差距较处理后6 d 缩小，而T0—T1处理较处理后6 d降低；处理后12 d，T2—T4处理Pn 继续提高，尤其是T3 处理，与CK 间的差距进一步缩小，T0—T1处理Pn继续降低。

图1 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Pn的影响Fig.1 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Pn of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.2 Tr 如图2所示，处理后3～12 d，T0—T4处理小麦幼苗叶片Tr 均低于CK；随着处理后时间的推进，T0—T4 处理Tr 明显降低，CK 总体上稍微降低，T0—T4 处理与CK 间的差距逐渐变大。处理后3 d，Tr表现为CK＞T4＞T3＞T1＞T2＞T0；处理后6 d，Tr表现为CK＞T2＞T4＞T3＞T1＞T0，T0—T4 处理与CK 间的差距较处理后3 d 加大；处理后9 d，Tr 表现为CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0，T0—T4 处理与CK 间的差距较处理后6 d 加大；处理后12 d，Tr 表现与处理后9 d 一致，T0—T4处理与CK间的差距达到最大，T0处理较CK降低37.8%，T3 和T4 处理分别较CK 降低21.8%和22.9%。

图2 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Tr的影响Fig.2 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Tr of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.3 Gs 如图3所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，T0—T4 处理小麦幼苗叶片Gs 逐渐降低，CK 先降低后升高；随着衣藻质量浓度增加，Tr总体上先升高后降低，处理后3 d、9 d 和10 d 均以T3 处理最高，处理后6 d 以T2 处理最高，总体以T0处理最低；T0—T4 处理Tr 均明显低于CK，T0—T4处理Tr 与CK 间的差距在处理后12 d 最大，且T3 和T4 处理与T0 处理间的差距也在处理后12 d 最大，分别较T0处理提高25.24%和22.33%。

图3 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Gs的影响Fig.3 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Gs of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.4 Ci 如图4 所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK 小麦幼苗叶片Ci无明显变化，T0—T1 处理先降低后趋于平稳，T2—T4 处理先降低后升高；T0—T4 处理间Ci 在处理后3 d 和6 d 差异均不明显，在处理后9 d 和12 d 差异变大，尤其是处理后12 d，处理后9 d 和12 d Ci 均表现为T3＞T4＞T2＞T1＞T0，在处理后12 d T3处理较T0处理提高62.4%。

图4 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Ci的影响Fig.4 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Ci of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

2.3.1 Fv/Fm 如图5 所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK 小麦幼苗叶片Fv/Fm 变化不大，维持在0.825～0.850，高于T0—T4 处理；T0—T4处理Fv/Fm 变化均较大，T0 和T2 处理均呈下降趋势，T3和T4处理均呈先下降后增加的趋势，T1处理呈先下降后升高再下降的趋势；T0—T4处理间Fv/Fm差异总体上逐渐增大。处理后9 d 和12 d，Fv/Fm 均表现为CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0；处理后12 d，T0 处理与CK间的差距达到最大，较CK降低7.3%。

图5 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Fv/Fm的影响Fig.5 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Fv/Fm of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.2 qP 如图6所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK 小麦幼苗叶片qP变化不明显，均远高于T0—T4 处理；T0—T4 处理qP 变化均较大，T0处理呈下降趋势，T1处理呈先下降后趋于平稳的趋势，T2—T4 处理均呈先下降后升高的趋势；T0—T4处理间qP差异总体上逐渐增大。处理后12 d，qP表现为CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0，T3 和T4 处理间差异较小，两者与T0处理间的差距均达到最大。

图6 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片qP的影响Fig.6 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on qP of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.3 qN 如图7所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK小麦幼苗叶片qN先下降后升高，以处理后6 d 最低；T0 处理qN 先升高后趋于平稳；T1—T4 处理qN 先升高后降低。在处理后6、9 d，T1—T4 处理qN 均高于CK、低于T0 处理；在处理后12 d，T1—T2 处理均高于CK，T3—T4 处理均低于CK，T1—T4处理均低于T0处理。

图7 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片qN的影响Fig.7 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on qN of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.4 Y（Ⅱ） 如图8 所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK 小麦幼苗叶片Y（Ⅱ）略有波动，高于T0—T4 处理；T0 处理小麦幼苗叶片Y（Ⅱ）一直下降，T1—T4 处理Y（Ⅱ）均先下降后升高最后趋于平缓，以处理后9 d 最高。处理后6、9、12 d，T1—T4 处理Y（Ⅱ）均高于T0 处理，T2—T4 处理Y（Ⅱ）均高于T1 处理，且T2—T4 处理间差异很小。处理后12 d，T3 和T4 处理Y（Ⅱ）分别较T0 处理提高31.35%和31.59%。

图8 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片Y（Ⅱ）的影响Fig.8 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Y（Ⅱ）of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.5 ETR 如图9 所示，处理后3～12 d，随着处理后时间的推进，CK 小麦幼苗叶片ETR 轻微波动，高于T0—T4 处理；而T0 处理在处理后3～9 d 急速下降，并在12 d 时达到最小，在处理后6～12 d，明显低于T1—T4 处理；T1 处理ETR 下降；T2 处理ETR 先下降后缓慢升高；T3—T4 处理ETR 均变化不大，在处理后6～12 d，高于T0—T2处理。

图9 衣藻质量浓度对盐胁迫下小麦幼苗叶片ETR的影响Fig.9 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on ETR of leaves of wheat seedlings under salt stress

3 结论与讨论

光合色素分子参与光合作用的原初反应且是类囊体的重要组成部分，光合色素含量在一定程度上可以表征植物光合作用的强弱，反映植物的健康程度[17]。有研究发现，盐胁迫条件下植物叶片的光合色素含量显著下降[18-19]，叶绿素a/b 出现严重失调，从而导致光合作用减弱[20]。本研究发现，在盐胁迫条件下，小麦叶片的叶绿素含量和叶绿素a/b 均明显下降，这与朱玉雪等[21]的研究结果一致。而施加藻液的各处理（T1—T4）小麦叶片的叶绿素a和总叶绿素含量及类胡萝卜素含量均高于T0处理，尤其是T3、T4处理，两者叶绿素a和叶绿素b含量无明显差异。这是因为微藻分泌的胞外多糖等物质可增强植物抗氧化酶活性，降低植物叶绿体内的活性氧含量，从而抑制光合色素分子的降解，提高小麦各种光合色素含量，改善叶绿素a/b，进而提升光合速率[22-23]。

当植物受到盐胁迫时，气体交换参数会发生显著变化，净光合速率下降，造成这种变化的原因是气孔或者非气孔因素，它们的区别在于Pn、Ci、Gs三者的变化趋势。当高等植物的Gs、Ci、Pn 同时上升或下降时，气孔因素占主导作用；当Pn 与Gs、Ci 变化趋势相反时，非气孔因素占主导作用[24]。在本研究中，在处理后3～12 d，各衣藻藻液处理（T1—T4）小麦叶片Pn 总体上均高于T0 处理，说明衣藻能改善盐胁迫下小麦叶片Pn。T0 处理小麦幼苗的Pn、Gs 和Ci 在处理后3～12 d 明显低于CK，说明在盐胁迫条件下，小麦叶片Pn 下降的主导因素是气孔因素。此外，施加衣藻藻液的各处理（T1—T4）在处理后6～12 d，小麦叶片Gs、Ci 均高于T0 处理，说明衣藻影响盐胁迫下小麦叶片Pn 的因素主要是气孔因素。本研究中，T2—T4 处理在处理后6～12 d Pn 明显高于T0处理，以T3处理效果最佳。

原初反应后所固定的光能主要有3 个去向，主要部分流向PSⅡ，另外两部分用于热耗散和以荧光的形式散发出去。叶绿素荧光检测技术正是基于此原理，通过检测植物发出的荧光信号来表征叶片光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配的内在特征[25-26]。其中，Fv/Fm 在高等植物中一般维持在0.80～0.85，而在植物受到外部胁迫时会迅速下降；此外，qP、ETR、Y（Ⅱ）也会下降，而qN 因光合机构产生更多过剩光能而增加。因此，Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）和qN 可以体现小麦受盐胁迫的程度和叶片吸收、转化光能的能力[27]。本研究中，T0 处理小麦叶片Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）在处理后3～12 d均低于CK；而qN 高于CK。处理后12 d T0 处理Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）较处理后3 d 均降低，这与其他人对盐胁迫下小麦[28]和桑树[27]的研究结果类似。这些结果说明小麦的光合生理过程对盐胁迫响应明显，盐胁迫导致小麦叶片对光能的吸收和转换能力变弱，PSⅡ反应中心开放程度降低，产生的过剩光能增加。本研究中，施加衣藻藻液处理（T1—T4）Fv/Fm、ETR、Y（Ⅱ）、qP总体上在处理后6、9、12 d均高于T0处理，而qN低于T0处理，这与其他促生长物质或肥料[29-32]对小麦叶绿素荧光参数的影响类似。在处理后9、12 d，T3 处理Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）和qN 与T4 处理差异不大，而T4 处理衣藻藻液的用量是T3处理的2 倍，从效果和经济性两方面评估，添加1.0 g/L 衣藻藻液为宜。说明衣藻能够有效改善盐胁迫下小麦叶片对光能的吸收和转换能力，维持PSⅡ反应中心的开放程度和PSⅡ的功能，增加对过剩光能的热耗散以提高对光合机构的保护作用，从而提升小麦叶片整体的光合作用能力。