罗幸凯，黄丽丽

南柴胡多糖理化性质及拮抗白细胞黏附研究

罗幸凯，黄丽丽

宁波市医疗中心李惠利医院药学部，浙江宁波 315000

探究南柴胡多糖（polysaccharide，BP）的理化性质、溶液高级构象及拮抗P-选择素介导的细胞黏附能力。采用水提醇沉法制备BP，利用化学法（苯酚硫酸法、间羟基联苯法、Bradford法）、高效液相色谱、傅里叶红外光谱、刚果红染色和圆二色谱分析BP的理化性质及溶液高级构象，利用细胞黏附和蛋白互作实验评价BP拮抗P-选择素介导的细胞黏附活性。BP是相对分子质量为36.44kDa的酸性杂多糖，糖醛酸含量为19.33%，由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5种单糖组成；BP在溶液状态下，不存在三股螺旋结构，分子具有明显的不对称性，但不对称性受浓度和温度影响；BP显著抑制P-选择素介导的HL-60与CHO-P细胞的黏附，并阻断P-选择素与P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）的相互作用。BP是由5种单糖组成的酸性多糖，能阻断P-选择素介导的白细胞黏附作用，具有开发成为新型抗炎药物的潜力。

南柴胡；多糖；理化性质；溶液构象；P-选择素；抗炎

柴胡是一味传统中药材，始载于《神农本草经》，至今已有上千年历史。《中国药典》2020年版规定本品为伞形科（北）柴胡（DC.）或狭叶（南）柴胡（Willd.）的干燥根，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气等功效[1]。南柴胡广泛分布于内蒙古、江苏、安徽等地区，主要含有黄酮类、皂苷类、多糖类等活性化合物，具有抗炎、镇痛、解热、保肝等药理活性[2-3]。但关于南柴胡多糖（polysscharide，BP）的高级构象及其抗炎活性的研究报道较少，为丰富BP的结构信息、发掘其生物活性，本研究运用多种化学和光谱分析方法揭示BP的理化性质及溶液高级构象，并利用静止黏附、平行板流动小室和体外蛋白互作实验评价其拮抗P-选择素介导的白细胞黏附能力，为促进南柴胡资源的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 BP的制备

采用水提醇沉法制备BP。取适量脱脂南柴胡粉末，沸水浸提3次（:=1 : 20），每次3h。合并提取液，过滤，减压浓缩。浓缩液中缓慢滴加95%乙醇至终浓度为80%，4℃静置过夜，经离心处理后收集沉淀，真空冷冻干燥。采用反复冻融法和Sevag法除去蛋白质，得BP。

1.2 理化性质分析

采用苯酚-硫酸法测定糖含量；采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量；蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法；采用TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司），在4000～400cm–1波长范围内进行扫描；利用Lambda 750紫外全波长扫描仪（美国PerkinElmer公司）在190～900nm波长范围内扫描多糖样品；采用高效液相色谱法测定BP的相对分子量。以不同分子量的葡聚糖标准品绘制标准曲线，将多糖样品的保留时间代入标准曲线，即得重均分子量；采用柱前衍生化及反相高效液相色谱法对单糖组成进行分析。首先将多糖样品进行酸水解，产物经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl- 5-pyrazolone，PMP）衍生化后进样，对比各单糖标准品衍生物的保留时间及峰面积，确定BP的单糖组成及摩尔比。

1.3 溶液高级构象分析

将刚果红试剂和BP配制成不同浓度（0～0.5mol/L）的NaOH溶液，在200～600nm范围内，进行紫外-可见全波长扫描，测定溶液的最大吸收波长λmax，以去离子水代替BP溶液作为对照。

采用Chirascan圆二色谱仪（英国Applied Photophysics公司）测定不同浓度和温度下BP溶液构象。检测条件为扫描波长范围190～400nm，带宽1.0nm，步进值1.0nm。

1.4 拮抗P-选择素介导的细胞黏附能力分析

1.4.1 细胞培养 中华仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞和人早幼粒白血病细胞（human myelocytic leukemia，HL-60）细胞购置于中科院上海细胞库。通过将全长人P-选择素载体转染到CHO细胞中，获得稳定表达P-选择素的CHO-P细胞。所有细胞均培养于Iscove Modified Dulbecco Media培养基，培养基中补充10%热灭活的胎牛血清，100units/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，培养箱环境设置为37℃和5%CO2浓度。

1.4.2 静止黏附实验 将CHO-P或CHO细胞接种到24孔板中过夜形成单层，分别与P-选择素阻断型抗体9E1、非阻断型抗体AC1.2及BP（100μg/ml和200μg/ml）于37℃孵育30min。将HL-60细胞用钙调蛋白-AM（5µm）进行荧光标记，并加入到CHO-P或CHO单层细胞中孵育1h。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤4次后，使用荧光酶标仪测量各孔荧光强度。

1.4.3 平行板流动小室实验 平行板流室分析BP阻断HL-60细胞和CHO-P单层细胞动态相互作用的能力。将CHO和CHO-P细胞分别接种在35mm培养皿中过夜形成细胞单层，分别加入9E1、AC1.2和BP（100μg/ml和200μg/ml），37℃孵育30min。将培养皿组装在平行板流动室（Glycotech公司，美国），并安装在倒置显微镜上进行观测。用PBS洗涤后，将HL-60细胞注入流动小室，并通过CCD随机选择视野记录3min。利用NIH ImageJ软件计算在CHO或CHO-P细胞上滚动的HL-60细胞数量和相对滚动速度。

1.4.4 体外蛋白结合测定 重组人P-选择素/Fc嵌合蛋白（P-Fc，2μg）与20μl Protein G琼脂糖凝胶在4°C下孵育1h后，加入BP（100μg/ml和200μg/ml）继续孵育1h。HL-60细胞经细胞裂解液冰上裂解30min，于4°C环境中以8000转/min的速度离心15min，将裂解液上清与包被P-Fc的Protein G凝胶孵育2h，经离心反复洗涤后，加入上样缓冲液并沸腾，免疫印迹法检测P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）及P-选择素含量，使用ImageJ软件对条带灰度值进行量化分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 BP的理化性质分析

采用水提醇沉法获得BP，收率为12.8%，BP的总糖含量为96.43%，其中糖醛酸含量为19.33%，而蛋白含量仅占0.33%，同时260nm和280nm处无吸收峰（图1A），表明BP中蛋白被有效除去。BP的相对分子质量为36.44 kDa，是由5种单糖组成的酸性杂多糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为0.23∶0.40∶1.00∶0.22∶0.32（图1B）。

BP的红外光谱结果如图1C所示。3384cm–1处为分子内羟基伸缩振动，为多糖的特征吸收峰；2931cm–1处的较弱吸收峰为C-H的伸缩振动；1746cm–1和1612cm–1吸收峰是由C=O和COO-的伸缩振动引起；1412cm–1处有吸收峰，表明存在糖醛酸；1100～1020cm–1区间及765cm–1的吸收峰表明单糖残基以吡喃环形式存在；831cm–1处的吸收峰，表明存在α-糖苷键。

2.2 BP的溶液高级构象分析

刚果红能够与具有三股螺旋构象的多糖形成络合物。在一定NaOH浓度范围，三股螺旋构象可通过可见光谱中最大吸收波长的红移来确定。与刚果红对照组相比，随着NaOH浓度的增加，刚果红-BP配合物的最大吸收波长均未发生红移（图1D），说明BP中不存在三股螺旋结构。

圆二色谱（circular dichroism，CD）可灵敏地反映生物分子的空间结构。在水溶液中，由于多糖分子之间存在相互作用，导致分子发生缠绕、折叠等无规则卷曲，使其产生不对称性，从而在CD谱上呈现明显Cotton效应[4]。不同浓度BP的溶液构象如图1E所示，改变浓度并未影响BP的峰形，但振幅强度发生了显著的变化，随着BP浓度的增加，200nm附近的吸收峰及负Cotton效应均大幅度增强，说明浓度升高会增加BP分子的不对称性。这可能是由于随着BP浓度的增加，多糖分子链间的作用力增强，从而使多糖分子链之间发生聚集和缠绕。温度对BP溶液构象有一定影响（图1F），当测定温度达到55℃时，BP的CD谱峰型发生偏移，并且Cotton效应增强、负Cotton效应减弱。多糖溶液构象受多糖分子间和分子内的氢键键合这种典型的热力学行为影响[5]。因此，BP溶液构象的改变极有可能是由于维系分子构象行为的氢键发生断裂所致。

图1 BP的理化性质及溶液构型分析

A.紫外可见光扫描图谱；B.单糖组成分析；C.红外光谱图；D.刚果红实验；E.圆二色谱（不同浓度）；E.圆二色谱（不同温度）

2.3 拮抗P-选择素介导的白细胞黏附能力

BP在100μg/ml和200μg/ml的浓度下，均可显著抑制HL-60和CHO-P细胞之间的静态黏附作用，黏附细胞比例分别下降到34.7%和11.3%，200μg/ml BP组的抑制作用接近P-选择素阻断型抗体9E1，见图2A。利用平行板流小室评价BP在动态条件下抑制细胞滚动黏附的作用效果。BP处理显著减少CHO-P细胞单层上滚动黏附的HL-60细胞比例，在100μg/ml和200μg/ml浓度作用下分别减少到40.2%和6.2%，200μg/ml BP组与阻断型单抗9E1的抑制效果接近（>0.05），图2B。另外，使用NIH ImageJ软件计算HL-60细胞的相对滚动速度（图2C），由于BP处理可抑制细胞间的黏附作用，与对照组相比，BP处理后HL-60细胞的相对滚动速度显著增加。

图2 BP拮抗P-选择素介导的白细胞黏附能力

A.静止黏附细胞比例；B.滚动黏附细胞比例；C.相对滚动速度

注：CHO-P：稳定表达P-选择素的CHO细胞；与对照组比较，*<0.001

PSGL-1是白细胞特异性表达的糖基化蛋白，是P-选择素介导白细胞在血管内皮起始招募和滚动黏附的重要生理配体。P-选择素与PSGL-1展现出较高的亲和力，而经过BP处理后，P-选择素与PSGL-1之间的相互作用明显减弱，100μg/ml和200μg/ml BP组分别降低55.3%和90.3%，见图3。上述结果表明，BP通过直接阻断P-选择素与PSGL-1之间的相互作用来抑制P-选择素介导的白细胞黏附作用。

图3 BP阻断P-选择素与PSGL-1的相互作用

注：与对照组比较，*<0.001

3 讨论

中药南柴胡为伞形科狭叶柴胡的干燥根，味苦，性寒，归肝、胆经，在临床上广泛应用于抗炎治疗。现代医学研究发现，其主要活性成分为柴胡皂苷、黄酮类、柴胡多糖等。本研究采用水提醇沉法制备的BP是由鼠李糖、半乳糖糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖等组成的酸性杂多糖，摩尔比为0.23 : 0.40 : 1.00: 0.22 : 0.32。肖炳坤等[6]发现北柴胡多糖中单糖组分主要是阿拉伯糖和半乳糖，分别占比46.0%和34.5%，还含有少量的鼠李糖、半乳糖醛酸和木糖等单糖成分。颜军等[7]从产自于四川省的柴胡中提取分离柴胡多糖，由木糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖5种单糖组成，其摩尔比为1.00 : 2.19 : 2.27 : 2.44 : 3.21。由此得出，不同产地和不同属的柴胡在单糖组成上存在一定的差异。

多糖的生物活性与其溶液高级空间构象密切相关[8]。β-（1-3）-D-葡聚糖的免疫调节活性被认为与其三股螺旋结构有关，当其变性后，免疫调节功能也随之消失[9]。因此，对多糖高级结构的研究将有助于阐释其构效关系。多糖在溶液中的构象特征包括多糖分子的尺寸、形态、刚性/柔顺性、无规线团、单股螺旋、双股螺旋和三股螺旋等[8]。尽管目前对柴胡多糖分子的一级结构已有一定了解，但空间构象、溶液行为及聚集态结构的研究在国内外鲜有报道。本研究通过刚果红实验和CD技术，探究BP的溶液行为，丰富BP的溶液高级构象信息。

中药多糖在炎症发生、发展的多个阶段均可展现抗炎能力，如抑制炎症信号传导，减少促炎细胞因子释放，阻止白细胞的黏附和浸润[10]。作为重要的细胞黏附分子，P-选择素参与活化的血管内皮对中性粒细胞的招募及黏附作用，在炎症发生、发展中起至关重要的作用[11]。因此，干预P-选择素介导的细胞黏附成为治疗炎症相关疾病的潜在策略。P-选择素与其生理配体的结合可被多种天然多糖拮抗[12-13]。在本研究中BP作为P-选择素高亲和力配体以拮抗其与PSGL-1的结合，阻断白细胞与血管内皮的识别与黏附，表明其具有开发成为抗炎功效的新型医药产品的潜质。然而，由于BP的复杂化学组成与高级构象，其构效关系仍不清楚。后续研究中有必要表征BP的精细结构并进行位点特异性修饰，以揭示BP与P-选择素的分子识别和相互作用模式。

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Physicochemical properties and antagonistic capacity against cell adhesion of polysaccharide isolated from

Department of Pharmacy, Ningbo Medical Center Lihuili Hospital, Ningbo 315000, Zhejiang, China

To preparepolysaccharide (BP) to characterize its physical and chemical properties, advanced structure in solution, as well as antagonistic capacity against P-selectin-mediated cell adhesion.BP was prepared by hot water extraction method, chemical methods (phenol sulfuric acid method, meta-hydroxybiphenyl method, Bradford method), high performance liquid chromatography, Fourier infrared transform spectroscopy, Congo red staining and circular dichroism were used to analyze the physical and chemical properties of BP and the advanced structure in the solution, we also evaluated its antagonistic function against P-selectin-mediated neutrophil adhesion.BP is an acidic heteropolysaccharide with a molecular weight of 36.44kDa. It contains 19.33% uronic acid content and is composed of five monosaccharides: Xylose, rhamnose, glucose, galactose, and arabinose. In its aqueous state, BP lacks a triple-helix structure, exhibiting pronounced asymmetry at the molecular level. However, this asymmetry is influenced by both concentration and temperature; BP significantly inhibited the P-selectin-mediated adhesion of HL-60 and Cho-P cells, and blocked the interaction between P-selectin and its physiological ligand P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1).polysaccharide BP is an acidic polysaccharide composed of 5 kinds of monosaccharides, and BP can block P-selectin dependent cell adhesion, these results provide a novel therapeutical strategy for amelioration of inflammation-related disease.

; Polysaccharide; Physical and chemical properties; Solution conformation; P-selectin; Anti-inflammation

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.30.011

浙江省宁波市医学重点学科建设项目（2022-F06）

黄丽丽，电子信箱：727751578@qq.com

（2022–10–28）

（2023–10–10）