韩 鹿，黄晓楚，韩远凤，马海宁，方桂娇

（广州工商学院，广东佛山 528138）

洛神花在我国福建、云南和广东等地都有种植，其花萼中富含黄酮类化合物、维生素C、氨基酸、花青素等，具有抗癌、抗炎症、降血糖、降血脂等功效[1]。洛神花所含有的天然色素提取物已作为无毒副作用的食品着色剂广泛应用于食品加工领域[2]。常见的黄酮类化合物提取方法包括有机溶剂提取法、热水浸提法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超声波微波协同萃取和水浴加热法等[3-4]。有机溶剂常被用来提取胞内水溶性较差的活性成分，提取过程中的高温在破壁的同时，可以提高目标提取物的溶解度[5]。微波及超声波辅助提取法利用物理手段加速细胞壁破裂、内容物的释放及溶剂与目标提取物的充分接触来提高提取效率[5-6]。

本研究采用乙醇溶液进行黄酮类物质提取，并以超声波破壁及水浴加热的方式辅助提高提取效率，并验证提取物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洛神花，大参林药店；芦丁标准品，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇，广东光华科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海易恩化学试剂有限公司。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

小型磨粉机，九阳股份有限公司；TD5台式低速离心机，上海利鑫坚离心机电子有限公司；KS-600D型超声波清洗机，宁波海曙科生超声设备有限公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ES500-1B电子天平，沈阳亮衡天平仪器有限公司；V-1000型可见分光光度计，上海翱艺仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 洛神花提取工艺及黄酮含量的测定

洛神花粉碎过40目筛，取一定量的粉末并加入一定浓度的乙醇水溶液，常温以600 W超声一段时间，然后在一定温度下浸提一段时间，在4000 r·min-1条件下离心10 min，取上层澄清提取液。

以芦丁为标准品测定黄酮含量，于510 nm波长处测量吸光度。总黄酮提取含量计算为

式中：C为洛神花总黄酮浓度，mg·mL-1；N为稀释倍数；V为洛神花提取液体积，mL；M为洛神花粉末质量，g。

1.2.2 单因素试验

固定料液比为1∶10（g∶mL），超声功率为600 W，超声时间为30 min，水浴温度为60 ℃，水浴时间为30 min。通过单因素试验分别考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25）、乙醇浓度（10%、20%、40%、60%和80%）、水浴温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）、超声时间（20 min、40 min、60 min、80 min和100 min）这4个因素对黄酮提取量的影响，以黄酮提取量为评价标准，筛选出每个因素的最佳水平。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果选取料液比、乙醇浓度、水浴温度以及超声时间4个因素，每个因素3个水平，以总黄酮提取量为指标进行L9(34)正交试验。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定

将1 mL不同黄酮浓度（0.5 μg·mL-1、0.7 μg·mL-1、0.9 μg·mL-1、1.3 μg·mL-1和2.6 μg·mL-1）的洛神花黄酮提取液与6.0 mL浓度为0.1 mg·mL-1的DPPH乙醇混匀，避光反应30 min。于517 nm波长处测量吸光度，以无水乙醇作为参比溶液，进行背景组和对照组的测定。DPPH自由基清除率计算为

式中：A0为1.0 mL无水乙醇+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（对照组）；A1为1.0 mL黄酮提取液+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（试验组）；A2为1.0 mL黄酮提取液+6.0 mL无水乙醇的吸光值（背景组）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

通过配制芦丁标准溶液得到510 nm处黄酮浓度C（mg·L-1）与吸光度A之间的回归曲线公式为A=12.089C-0.0134，R2=0.9993，将测得的洛神花提取液吸光度代入此公式即可计算出洛神花中总黄酮浓度。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对洛神花总黄酮提取量的影响

由图1可知，洛神花提取液的料液比为1∶10（g∶mL）时提取出的总黄酮含量最高。在料液比较低的情况下，溶剂量太少使洛神花粉末与溶剂接触不充分，过高的料液比会使黄酮受到胞内其他化合物竞争性溶出的影响，降低总黄酮提取量。因此，该条件下最优料液比为1∶10（g∶mL），选择1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）进行正交试验。

图1 料液比对洛神花总黄酮提取量的影响

2.2.2 乙醇浓度对洛神花总黄酮提取量的影响

由图2可知，在乙醇浓度为40%时，洛神花提取液中总黄酮含量最高，黄酮与乙醇的极性相近，在40%乙醇中的分配比最大。因此，选择浓度为30%、40%、50%的乙醇进行正交试验。

图2 乙醇浓度对洛神花总黄酮提取量的影响

2.2.3 水浴温度对洛神花总黄酮提取量的影响

由图3可知，在水浴温度为70 ℃时，洛神花提取液中总黄酮含量达到最高值。在温度较高的条件下，总黄酮极易发生氧化分解，从而影响总黄酮的提取量。因此，选择60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴温度进行正交试验。

图3 水浴温度对洛神花总黄酮提取量的影响

2.2.4 超声时间对洛神花总黄酮提取量的影响

由图4可知，在超声波处理时间为80 min时，洛神花提取液中总黄酮含量达到最高值，随后逐渐降低。超声波的机械振动和空化效应，可以破坏植物细胞的结构，从而让溶剂更快地渗入细胞中，由此提高了细胞中物质的溶解速率，增加了黄酮得率。超声波作用的时间较短时，破壁效果不充分总黄酮尚未全部溶出；随着超声波作用时间的延长，细胞内的类黄酮成分与乙醇溶液完全作用，使得更多的类黄酮成分溶解出来，从而提高了提取率；但超声过程过久也会使其他非黄酮成分溶解，使总黄酮含量下降。因此，选择超声时间为70 min、80 min、90 min进行正交试验。

图4 超声时间对洛神花总黄酮提取量的影响

2.3 正交试验结果

由表2中R值可以得出，洛神花总黄酮提取量的影响因素主次顺序是A＞C＞D＞B，即料液比＞水浴温度＞超声时间＞乙醇浓度。正交试验中的最优工艺与由K值得到最佳工艺一致，最优工艺参数为A2B2C3D1，即料液比1∶10（g∶mL）、乙醇浓度40%、水浴温度80 ℃、超声时间70 min。此工艺下，洛神花总黄酮提取量为32.36 mg·g-1。

表2 正交试验方案与结果分析表

2.4 DPPH自由基清除率分析

由图5可知，黄酮浓度为0.5 μg·mL-1时，洛神花提取液的DPPH自由基清除率为41.77%。黄酮浓度为2.6 μg·mL-1时，洛神花提取液的DPPH自由基清除率达到99.85%，洛神花提取液对DPPH自由基的清除作用十分明显。

图5 DPPH自由基清除率

3 结论

本研究以洛神花总黄酮提取量为考察对象，对不同料液比、乙醇浓度和水浴温度以及超声波作用时间进行了单因素试验，并通过正交试验确定最佳提取工艺。结果表明，影响洛神花总黄酮提取量的因素主次顺序为料液比＞水浴温度＞超声时间＞乙醇浓度，最佳提取工艺为洛神花粉末与40%乙醇溶液的料液比1∶10（g∶mL）、超声波提取70 min、80 ℃水浴加热30 min，使用此提取方法得到的总黄酮含量为32.36 mg·g-1。本研究将超声波辅助提取法、乙醇溶液提取法与水浴加热法3种方法结合起来提取洛神花总黄酮，工艺条件安全、稳定、经济、环保，能够有效提高总黄酮的提取量，为洛神花的提取工艺研究提供了理论依据。