UPLC-MS/MS法测定酱香型白酒原辅料中非挥发性酚酸

2023-11-11骆茂香陈仁远

食品安全导刊 2023年27期

骆茂香，刘磊，陈雯，陈仁远*

（1.贵州省酒类产品质量检验检测院，贵州仁怀 564500；2.茅台学院，贵州仁怀 564500）

酚酸是酚类化合物，是食品中主要抗氧化物质的来源，其组成及含量对抗氧化活性起着决定性作用[1]。非挥发性酚酸包括原儿茶酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等[2]。白酒酿造用原辅料如高粱、大曲中存在一些酚酸类物质，原辅料在各酶系、微生物的作用下也会生成一些酚酸，这些活性物质经过酿造、蒸馏等过程进入酒体，赋予白酒特殊的苦味和坚果香气，不仅影响白酒的风格和口感，增加白酒风味层次感，同时还具有抗氧化的作用[3-5]。有研究报道，酚酸对冠心病、糖尿病、高血脂、痛风等都有一定的预防作用[6-10]。阿魏酸是一种抗氧化剂，也是防癌物质，具有抗炎镇痛的功效[11]。因此，对白酒酿造原辅料中的酚酸进行定量有助于监控白酒的质量，提升白酒的品质。

目前，对酚酸进行检测的方法主要有薄层色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13]、液相色谱-串联质谱法[14]等。酚酸类物质在酱香型白酒和其原辅料中含量较低，并且大多研究旨在检测白酒中酚酸的含量，对白酒原辅料中酚酸含量的研究较少。因此，本研究采用液相色谱-串联质谱法对白酒原辅料中的非挥发性酚酸进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仁怀酱香型白酒核心产区所用大曲、高粱；原儿茶酸（99.0%）、对香豆酸（99.7%）、绿原酸（98.9%）、咖啡酸（99.7%）、阿魏酸（99.9%），阿尔塔公司；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（色谱纯，科密欧公司）；超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

漩涡振荡器（XH-B，江苏天翎公司）；台式电子天平（精确度0.0001 g，赛多利斯公司）；0.44 μm滤头；离心机（TD4Z-WS，湖南湘立公司）；液相色谱质谱联用仪（Thermo Ultimate 3000，美国赛默飞世尔科技公司）；超纯水机（Milli-Q，Millipore公司）；电子天平（精度0.0001 g，赛多利斯公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

粉碎高粱、大曲后分别过40目、20目筛，参照赵尚碧等[15]的样品预处理方法对样品前处理条件进行优化。分别称取5 g（精确至0.001 g）高粱或大曲粉末样品于50 mL离心管中，加入50%甲醇水溶液20 mL，振荡5 min后，以3000 r·min-1离心30 min，吸取0.200 mL上清液于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤，待测。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇，洗脱程序：0～15.00 min，5%→100% B，15.10～17.00 min，100% B，17.10～20.00 min，5% B；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.25 mL·min-1。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），负离子模式；选择反应监测模式（Selected Reaction Monitoring，SRM）；毛细管温度：300 ℃；雾化气温度：320 ℃；鞘气压力：25 Arb；喷雾电压：3500 V。5种酚酸的质谱分析参数见表1。

表1 5种酚酸的质谱分析参数

1.3.3 酚酸标准溶液的配制

标准溶液配制：分别取一定质量的5种酚酸标准品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成一定浓度的标准储备液，在-20 ℃冷冻保存。用甲醇稀释标准储备液，配制5种酚酸混合标准工作液，现配现用。标准溶液配制浓度见表2。

表2 标准溶液配制

1.3.4 数学模型

样品中酚酸含量的计算公式为

式中：C为待测组分的含量，g·kg；C测为由标准曲线得出的待测物的质量浓度，μg·L-1；m为所称取的样品质量，g；V为定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

对原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸5种目标化合物标准工作溶液进行测定，并绘制标准曲线，结果如表3所示。原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸的标准曲线相关系数均大于0.995，相关系数满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的对于确认方法相关系数不应低于0.99的要求。

表3 目标化合物标准曲线线性方程

2.2 精密度实验

配制原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸在高粱和大曲中3个浓度水平的样品添加溶液，分别进样6次计算精密度。由表4可知，5种酚酸在高粱、大曲中的精密度试验中变异系数为0.6%～6.3%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的精密度试验中变异系数小于7.5%的要求。

表4 目标化合物检测方法的精密度实验结果

2.3 回收率及准确度实验

在空白样品中分别添加原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸标准溶液，在S1、S2、S53个浓度水平进行回收率和准确度试验，每个浓度水平添加3个平行样。由表5可知，在3个加标水平下，化合物的回收率在94.2%～108.1%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的回收率为90%～120%的要求。各样品化合物在S1、S2、S53个空白加标浓度水平的准确度偏差在-5.8%～8.1%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS-CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的准确度偏差在-20%～20%的要求。