栾金玲，朱娅敏，陈智仙，梁秋元，程 倩*

（1.农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，湖北宜昌 443003；2.宜昌市营养健康食品工程技术研究中心，湖北宜昌 443003；3.酵母功能湖北省重点实验室，湖北宜昌 443003）

肝脏对人体外来和自身代谢产生的许多有害因素具有强大的防御解毒功能，是人体消化系统中最大、最重要的消化腺体[1]。长期大量饮酒可引起肝脏、胃、心脏、脑组织等多个脏器损害，尤其是对肝脏的损伤最严重。在非病毒性肝病中，酒精性肝病居首位，重度饮酒者中，80%以上患脂肪肝，10%～35%可发展成酒精性肝炎，10%～20%将发展成肝硬化，而酒精性肝硬化预后差，比非酒精性肝硬化生存时间明显缩短。目前，解酒保肝已成为医学界与生物界需要解决的问题，加强对其的研究十分迫切。已有研究表明，乙醇肝损伤的机制与肝细胞膜脂质过氧化增强密切相关[2]。在当前的治疗中，对于酒精肝损伤患者，戒酒是西方国家的主要治疗方式，更为有效的治疗手段还在研究中。因此，国内和国外出现了很多保护肝脏的健康食品，用来缓解肝损伤，我国有很多食品具有很好的加速酒精代谢和保护肝脏的功能。

姜黄素是姜科植物（姜黄、莪术、郁金等）的主要生物活性成分之一。近几年研究结果显示，姜黄素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗血管生成、清除自由基、保护心血管系统和消化系统等功效[3]。此外，研究发现姜黄素对于酒精性肝损伤具有很好的修复作用[4-7]。硒具有保护肝脏和防治肝病的功能，是人体内所必需的微量营养元素之一[8-11]。硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的重要组成成分，作为人体必需的微量元素，可以清除体内的过氧化物质，避免细胞膜的结构和功能受到过氧化物的损害，从而降低机体的氧化损伤[12]。富硒酵母是一种经生物工程技术转化产生的富含微量元素硒的有机生物制剂，其含有的硒能被人和动物最大程度地吸收并参与机体代谢。目前，已经获得卫健委的批准，富硒酵母可以作为营养强化剂和保健食品原料使用。姜黄素和富硒酵母作为食品原料，在营养保健食品的使用中具有法规限量。为了扩大姜黄素和富硒酵母在食品中的应用范围，同时为了提高人们对于日常护肝的意识，本文研究了低剂量的姜黄素和富硒酵母对于酒精性肝损伤小鼠的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

富硒酵母（硒含量2000 mg·kg-1），安琪酵母股份有限公司；姜黄素，Sami-Sabinsa Group Limited，保存条件为阴凉干燥；甘油三酯测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒，南京建成生物有限公司；还原型谷胱甘肽测定试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术研究所。

1.2 实验动物

SPF级C57BL/6J、雄性成年小鼠60只，体重18～20 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK<湘>2019-0004，于华中科技大学同济医学院农药毒理研究中心饲养[实验动物设施许可证号：SYXK（鄂）2019-0046]。环境温度（20±2）℃，相对湿度55%～75%。小鼠饲料由华中科技大学同济医学院农药毒理研究中心提供。

1.3 仪器与设备

电子天平，德国Sartorious；多功能酶标仪，美国BioTek公司；5810R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；荧光倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂；恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；恒温培养箱，日本SANYO 公司；KZ-III研磨仪经济型，天津赛维尔公司。

1.4 实验方法

采用《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》中第19项“对化学性肝损伤有辅助保护功能”方案二（酒精肝损伤模型）方法。将60只成年小鼠随机分为5组，每组12只，受试物具体分组如下：①姜黄素剂量组[姜黄素16.67 mg·（kg bw）-1]；②富硒酵母组[富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；③姜黄素剂量联合富硒酵母组[姜黄素16.67 mg·（kg bw）-1+富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；④模型组给予50%分析纯乙醇（无水乙醇与蒸馏水为1∶1稀释）一次性灌胃，灌胃量为12 mg·（kg bw）-1；⑤空白组给予蒸馏水。受试样品每日经口灌胃给予实验小鼠，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水，连续灌胃30 d。小鼠采用标准饲养环境，自由饮食饮水。每天观察小鼠的摄食、饮水、活动和一般情况，每周称重2次，按体重调整受试样品剂量。急性酒精性肝损伤造模于实验第30天进行，除空白对照组外，其余小鼠给予50%分析纯乙醇（无水乙醇与蒸馏水为1∶1稀释）一次性灌胃，灌胃量为 12 mg·（kg bw）-1，空白对照组给予等量蒸馏水。禁食不禁水16 h后处死动物，取材进行各项指标的检测及病理组织学检查。

1.4.1 肝组织匀浆制备

取100 mg肝组织，加入900 μL PBS，振动研磨。充分研磨后，10000 r·min-1离心10 min，取上清，通过生化试剂盒测定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、甘油三酯（Triglyceride，TG）及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量。

1.4.2 肝脏组织病理学观察

小鼠肝脏脂肪沉积采用油红O染色法，肝脏组织在最佳切削温度条件下用包埋机进行包埋，获得冰冻组织切片，用油红O进行染色，然后在光学显微镜下观察脂滴在肝脏组织中的分布范围与面积。若脂滴在肝细胞内散在分布和稀少则计0分；若脂滴不超过肝脏组织面积的1/4则计1分；若脂滴不超过肝脏组织面积的1/2则计2分；若脂滴不超过肝脏组织面积的3/4则计3分；若脂滴填充了整个肝脏组织则计4分。

1.4.3 统计学方法

采用Minitab 20统计软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（x—±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05时认为差异有统计学意义。

1.5 结果判定

以下任何一个结果阳性，即判定该受试样品对酒精性肝损伤具有辅助保护作用。①肝脏MDA、还原型GSH和TG 3项检测结果呈阳性。②肝脏MDA、还原型GSH和TG 3项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。

2 结果与分析

2.1 肝脏指数的变化

由表1可知，各组小鼠的初始体重及最终体重均无显著差异（P＞0.05）。实验数据表明，相比空白组，模型组（即只喂食酒精）的小鼠肝脏指数显著增加；与模型组相比，姜黄素组及姜黄素联合富硒酵母组小鼠肝脏指数下降，且差异具有显著性，表明姜黄素及姜黄素联合富硒酵母能够保护小鼠因急性酒精灌胃导致的肝脏受损肿大。

表1 小鼠肝脏指数的变化结果（x—±s）

2.2 肝脏组织TG、MDA、GSH的水平

与空白组相比，模型组小鼠肝脏TG、MDA水平显著增加（P＜0.05）。急性酒精灌胃后，姜黄素组、富硒酵母组及姜黄素联合富硒酵母组小鼠的肝脏TG水平较模型组显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，各剂量组小鼠肝脏MDA水平明显下降，且差异具有显著性。然而，相比于空白组，模型组小鼠肝脏GSH水平有所上升，但无统计学差异，可能与急性酒精灌胃后GSH水平应激性升高相关。各样品组小鼠肝脏GSH水平较模型组均明显升高，且差异具有显著性（见表2），可见姜黄素单方、富硒酵母单方、姜黄素联合富硒酵母均可以降低急性酒精性肝脏损伤小鼠肝脏组织TG、MDA水平。另外，从数据也可以看出，姜黄素联合富硒酵母的效果优于两种物质单方的结果，说明姜黄素与富硒酵母具有协同的作用。

表2 小鼠肝脏组织TG、MDA、GSH的水平（x—±s）

2.3 肝脏组织脂质沉积情况

油红O染色实验结果显示，少量、小体积、分布均匀的橘红色小脂滴分散在空白组小鼠肝脏细胞中。大量弥漫性、大小不一的橘红色脂滴在模型组小鼠肝细胞内聚集，与空白组相比体积增大。而相较于模型组，姜黄素、富硒酵母、姜黄素联合富硒酵母小鼠肝细胞内橘红色脂滴数量减少、体积减小，且差异明显（见图1）。各组小鼠肝脏组织脂肪肝沉积评分结果如表3所示，相对于空白组，模型组小鼠肝脏病理得分增加，脂肪面积占比显著升高，且差异具有显著性（P＜0.05）。与模型组相比，各样品组小鼠肝脏病理得分有所下降，脂肪面积占比显著降低（P＜0.05），表明姜黄素单方、富硒酵母单方、姜黄素联合富硒酵母复方均能够缓解急性酒精性肝脏脂质沉积。从脂肪面积比的结果看，姜黄素联合富硒酵母复方具有协同的作用。

图1 光学显微镜下小鼠肝脏组织状况（油红O染色，×100）

表3 小鼠肝脏组织脂质沉积情况

3 结论

根据前期学者的研究[9-11,13-15]，本次研究中富硒酵母（硒含量2000 mg·kg-1）、姜黄素的成人摄入量分别为45 mg·d-1[0.75 mg·（kg bw）-1]、100 mg·d-1[1.67 mg·（kg bw）-1]，其中硒的含量为90 μg·d-1，实验选用成年雄性C57BL/6J小鼠，样品分别按人体推荐量的10倍经口灌胃给予受试物，同时设立空白对照组和模型对照组。实验结果表明，与模型组相比，姜黄素及姜黄素联合富硒酵母组小鼠肝脏指数显著降低；姜黄素、富硒酵母及姜黄素联合富硒酵母组小鼠肝脏组织TG水平显著下降；各样品组小鼠肝脏组织MDA水平显著下降；肝脏组织GSH水平显著增加。油红O染色结果显示，相较于模型组，喂食了姜黄素、富硒酵母和姜黄素富硒酵母组合物的小鼠肝细胞内橘红色脂滴面积和体积均明显减少，脂肪面积占比降低，且差异具有显著性。

根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中判定结果，满足以下任一条件，可判定受试样品具有对酒精性肝损伤有辅助保护作用。①肝脏MDA、还原型GSH和TG 3项检测指标结果阳性。②肝脏MDA、还原型GSH和TG 3项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。本实验肝脏MDA、还原型GSH和TG 3项检测指标以及病理组织学检查结果均为阳性，判定姜黄素单方、姜黄素联合富硒酵母复方对化学性肝损伤具有辅助保护功能。